Наблюдение за биологическим образцом с помощью JEM-1400Flash ー Поток от подготовки образца до наблюдения ー

Введение

Использование электронного микроскопа позволяет наблюдать микроструктуры в клетке, что невозможно с помощью оптического микроскопа. Для понимания подробной структуры органелл, таких как митохондрии и хлоропласты, электронный микроскоп является мощным инструментом. Однако с помощью ПЭМ наблюдение за образцом в живом состоянии невозможно, так как наблюдение проводится в вакууме. Кроме того, для передачи электронного луча образцы должны быть тонко нарезаны.
Для этой цели подготовка образца является очень важным шагом для понимания структуры мишени без артефактов. В этих указаниях по применению описывается процесс пробоподготовки биологических образцов на примере растительной ткани для представления данных, полученных с помощью JEM-1400Flash.

Процесс подготовки образцов

Существуют различные методы подготовки биологических образцов. В качестве примеров мы вводим фиксацию образца с использованием метода химической фиксации и метода ультратонких срезов с использованием ультрамикротома. Процесс подготовки образцов следует в следующем порядке: 1. Нарезка образца, 2. Фиксация, 3. Дегидратация, 4. Замена, 5. Заливка, 6. Полимеризация, 7. Обрезка, 8. Ультратонкие срезы, 9. Окрашивание. Каждый процесс описан ниже.

1. Резка образца

Образец разрезают на мелкие кусочки с помощью лезвия бритвы, чтобы химические вещества, которые будут использоваться для дальнейшей обработки, могли легко проникнуть внутрь.

2. Фиксация

Процесс остановки структурных изменений биологических образцов с помощью лишь нескольких артефактов. При химической фиксации фиксацию проводят дважды: префиксационную и постфиксационную. Префиксация используется для фиксации белков, а постфиксация — для фиксации липидов.
Примечание. Тетроксид осмия очень летуч и реактивен и может повредить дыхательную систему, кожу и слизистые оболочки пользователя. Так, процесс должен выполняться в вытяжке пищевых продуктов.

Реактивы

• Раствор префиксации: 2.5 % глутарового альдегида и 2 % параформальдегида в 0.1 М HEPES*¹ (полукарновский)
• Раствор для постфиксации: 1 % раствор четырехокиси осмия (OsO₄ в 0.1 М HEPES)
• Промывочный раствор: 0.1 М HEPES или дистиллированная вода.
• Бутылка для образцов

^*1 HEPES: сокращение от буферного раствора 2-[4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинил]этансульфоновой кислоты.

3. обезвоживание

Используйте этанол или ацетон для обезвоживания содержания воды в клетках. Если влага останется, оставшееся содержание воды предотвратит полимеризацию смолы при последующей заливке смолы. Следуйте инструкциям ниже, чтобы замочить образец в каждой концентрации этанола, чтобы заменить содержание воды этанолом.

4. Замена

При обезвоживании этанолом его заменяют оксидом пропилена (PO) или подобным ему в качестве промежуточного агента для смешивания с эпоксидной смолой.

^*2 ЭПОН 812: смола, ^*3 ДДСА・^*4 МНА: отвердитель, ^*5 ДМП-30：ускоритель

5. Встраивание

Чтобы подготовить ультратонкий срез, необходимо залить образец твердым заливочным веществом, таким как смола.
Жидкая смола будет отверждена в процессе полимеризации позже.

Инструменты

• Эпоксидная смола
• Пластина для заливки кремния (рис. 1)

• Залить смолой
• Поместите образец на кончик пластины для заливки кремния.
• Дайте ему постоять некоторое время, чтобы смешаться

Рис. 1 Пластина для заливки кремния

6. Полимеризация

Нагрейте смолу для отверждения, чтобы можно было нарезать смолу тонкими ломтиками. Поместите пластину для заливки кремния в духовку и держите ее при температуре 60 ° C в течение трех дней. Стабилизация температуры во время полимеризации может предотвратить разрушение смолы при полимеризации.

Инструменты

• Печь для полимеризации смолы

7. Обрезка

Обрежьте образец под оптическим микроскопом так, чтобы наблюдаемая область имела размер, необходимый для размещения на сетке образца, и придайте форму наблюдаемой поверхности.

Инструменты

• Лезвие бритвы
• Оптический микроскоп

8. Ультратонкие срезы

Удалите смолу, чтобы обнажить поверхность ткани с помощью стеклянного ножа. Затем с помощью алмазного ножа и ультрамикротома разрезают на ломтики, достаточно тонкие для пропускания электронного луча, и помещают на сетку.

Инструменты

• Ультрамикротом
• сетка
• Алмазный нож
• Стеклянный нож

• Зонд для ресниц (рис. 2)

Рис. 2 Зонд для ресниц

9. Окрашивание

Эта операция используется для усиления контраста биологических образцов, содержащих много легких элементов. Контраст рассеяния усиливается за счет связывания тяжелых элементов с образцом. При окраске ультратонких срезов на сетке проводят двойное окрашивание с использованием уранилацетата и цитрата свинца в качестве красителей. Уранилацетат окрашивает нуклеоплазму и рибосомы, а цитрат свинца окрашивает клеточную мембрану, гранулы гликогена и рибосомы.

Реактивы

• Уранилацетат^*6
• Ведущий цитрат

^*6 Уранилацетат — это соединение, которое находится под международным контролем и может использоваться только на лицензированных объектах.
Альтернативные растворы ацетата уранила включают ацетат иттербия.

Результат

На рис. 3 показаны результаты наблюдения образца ультратонкого среза, полученного в соответствии с описанной выше процедурой с использованием ПЭМ (JEM-1400Flash).

Рис.3 ПЭМ-изображения кленового листа
Мембранная структура органеллы может быть четко захвачена.
На левом изображении рисунка 3 аппарат Гольджи виден в центре и хлоропласты с обеих сторон.
На изображении справа показана структура митохондриальной мембраны.