Измерения белков с высоким разрешением с использованием спирального режима JMS-S3000 «SpiralTOF™» [приложение MALDI]
MSTips №297
Введение
JMS-S3000 «SpiralTOF™» представляет собой времяпролетный масс-спектрометр (TOFMS), использующий матричную лазерную десорбционную ионизацию (MALDI).
MALDI — это метод мягкой ионизации, который обычно сохраняет ионы нетронутыми во время ионизации. Однако также хорошо известно, что во время анализа MALDI происходит спонтанная фрагментация после ионизации, называемая распадом после источника (PSD).
В частности, по мере увеличения молекулярной массы аналита эффект PSD становится более выраженным, что усложняет результирующие масс-спектры и уменьшает общие сигналы аналита. SpiralTOF™ имеет 17-метровый изогнутый ионный оптический путь, который автоматически уменьшает количество ионов PSD, достигающих детектора, тем самым сводя к минимуму сложность масс-спектров. Кроме того, выбор подходящей матрицы может уменьшить PSD, что, в свою очередь, может улучшить сигнал интактного белка.
В этом исследовании мы использовали JMS-S3000 для тестирования нескольких матриц на эффекты PSD и для измерения масс-спектров высокого разрешения интактного инсулина, убиквитина и цитохрома C.
Эксперимент
В этих экспериментах использовали три белка – инсулин (10 пмоль/мкл 1% TFA), убиквитин (100 пмоль/мкл воды) и цитохром С (10 пмоль/мкл воды).
ClCCA (4-хлор-α-цианокоричная кислота) [1] растворяли в 70% ацетонитриле/0.1% ТФУ (10 мг/мл). Кроме того, инсулин также измеряли с использованием CHCA (α-циано-4-гидроксикоричная кислота) и SA (синапиновая кислота), которые обычно используются для измерения белков.
Смешанный раствор образца и каждой матрицы наносили на пластину-мишень и сушили на воздухе. Масс-спектры были получены с использованием режимов положительных ионов SpiralTOF и LinearTOF.
Итоги
В качестве отправной точки использовался режим LinearTOF для измерения инсулина с каждой матрицей (CHCA, SA и ClCCA), как показано на рисунке 1.
В каждом случае [M+H]+ пик показал хорошее соотношение сигнал/шум для всех матриц при использовании эквивалентных условий измерения. Эти результаты LinearTOF показывают состояние ионов сразу после области ускорения, где эффекты PSD обычно незначительны.
Только пик масс-спектра CHCA показал более широкую форму пика, что указывает на относительно больший эффект PSD. Затем эти пятна были повторно измерены в режиме SpiralTOF, и полученные масс-спектры показаны на рисунке 2.
Масс-спектры для всех матриц показали [M+H]+ пики с хорошим разделением изотопных пиков. Однако масс-спектр CHCA показал более низкое отношение сигнал/шум, чем масс-спектры SA и ClCCA, что подтверждает наблюдение режима LinearTOF о более высоком эффекте PSD для этой конкретной матрицы. Оба масс-спектра SA и ClCCA показали пики инсулина с хорошим отношением сигнал/шум для одинаковых условий измерения. В частности, пик инсулина ClCCA показал гораздо более высокое отношение сигнал/шум, чем две другие матрицы, что указывает на то, что эта матрица лучше подходит для минимизации эффектов PSD.
Рисунок 1. Масс-спектры инсулина, полученные в режиме LinearTOF с условиями матрицы (A) CHCA, (B) SA и (C) ClCCA.
Рис. 2. Масс-спектры инсулина, полученные с использованием режима SpiralTOF с условиями матрицы (A) CHCA, (B) SA и (C) ClCCA.
Затем масс-спектры убиквитина и цитохрома С были получены в режиме SpiralTOF с использованием ClCCA (рис. 3).
[М+Ч]+ ионы наблюдались для обоих белков с хорошим отношением сигнал/шум. Кроме того, изотопные пики убиквитина и цитохрома С были хорошо разрешены, а разрешающая способность по массе для каждого соединения составляла приблизительно 48000 и 36000 соответственно.
Рисунок 3. Масс-спектры убиквитина (А) и цитохрома С (В) в режиме SpiralTOF с использованием ClCCA.
Обзор
SpiralTOF™ эффективен для измерения интактных белков с высоким разрешением. Выбор подходящего матричного соединения, такого как ClCCA, может помочь уменьшить эффекты PSD, что, в свою очередь, улучшает измерение белков с молекулярной массой более 5000 Да.
Справка
[1] Ясколла Т.В., Леманн В.Д., Карас М. 4-Хлор-α-цианокоричная кислота представляет собой передовую, рационально разработанную матрицу MALDI. Proc Natl Acad Sci USA 2008;105:12200–12205.
- Дополнительную информацию см. в файле PDF.
Другое окно открывается при нажатии. 
PDF 594KB
Вы медицинский работник или персонал, занимающийся медицинским обслуживанием?
Нет
Напоминаем, что эти страницы не предназначены для предоставления широкой публике информации о продуктах.