Графики базовой фракции KMD для высокомолекулярного полиэфира поли(3-гидроксибутират) после его щелочной деградации на пластине и анализа SpiralTOF™» [Приложение MALDI]

Введение: математическая основа

Полимеры с высокой молекулярной массой часто не реагируют на МС из-за присущей им высокой дисперсности (Đ_M) или обнаруживаются в диапазоне высоких масс с низкой разрешающей способностью. Таким образом, щелочная деградация «на пластине» была разработана в качестве предварительной обработки образца на мишени MALDI десятыми долями нг полимера для разрезания длинных цепей промышленного полиэфира на короткие олигомеры, поддающиеся MALDI-HRMS [1]. Сложный масс-спектр олигомеров P3HB был проанализирован с помощью графика массового дефекта Кендрика (KMD) на основе фракции [2]. Анализ KMD на основе дроби был разработан на основе обычного анализа KMD для изменения аспекта и возможностей разделения графиков KMD в зависимости от делителя (отмечено X) в дополнение к базовой единице (отмечено R) через основание дроби R / X [3 ].

Экспериментальный

Поли(3-гидроксибутират) (P3HB, M_n = 2.6 × 10⁵ г моль^-1, Đ_M= 2.7) был от Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США). Все остальные химикаты и растворители были получены от FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation (Осака, Япония), если не указано иное. 1 мкл P3HB в ТГФ при концентрации 1 мг/мл^-1 отливали на одноразовую мишень MALDI (Hudson Surface Technology, Нью-Джерси, США) для формирования тонкого полимерного слоя. 1 мкл гидроксида натрия в метаноле (10 мг мл^-1) наносили на слой образца и оставляли сушиться на воздухе в течение 5 мин. Избыточное количество щелочного реагента промывали дистиллированной водой. После высушивания 1 мкл 2,4,6-тригидроксиацетофенона (THAP, Protea Biosciences, Западная Вирджиния, США) в ТГФ (20 мг мл^-1) наносили на пятно образца в качестве матрицы. Масс-спектры регистрировали с помощью масс-спектрометра JMS-S3000 SpiralTOF™. Графики были рассчитаны с использованием msRepeatFinder 3.0 из списка пиков, экспортированного с помощью msTornado™.

масс-анализ МАЛДИ

Интенсивные ионные серии олигомеров P3HB наблюдаются в MALDI-MS (рис. 1А). Обнаружено шесть основных серий, различающихся по их концевым группам (рис. 1Б), но определение и визуализация всех конгенеров остается трудоемким и плохо интуитивным.

Рис. 1. (A) MALDI SpiralTOF масс-спектр высокомолекулярного P3HB после его деградации на планшете (вставка: увеличенный снимок с присвоениями). (B) Серия ионов P3HB отмечена I-VI.

Обычные и улучшенные графики KMD

На обычном графике KMD, рассчитанном по спектру масс MALDI, отображается облако точек, выровненных по горизонтали (Рис. 2A). Увеличение является обязательным, поскольку точки сгруппированы в пределах ограниченной части графика из-за очень ограниченного изменения KMD с изменением состава изотопов или концевых групп [4]. Видны две плохо разрешенные группы точек (2B), в то время как ожидается шесть серий с учетом масс-спектральных данных.

Рис. 2. Полномасштабный регулярный график КМД из масс-спектра P3HB с C₄H₆O₂ в качестве базового блока с помощью msRepeatFinder.

Активировав опцию «Фракционный базовый KMD» в msRepeatFinder и уменьшив значение X с 86 (обычный график KMD) до 85, график KMD с улучшенным разрешением значительно разделит шесть серий P3HB в полном масштабе благодаря большей вариации KMD по изменение состава (Рис. 3A). Уменьшая X на одну единицу при X = 84, график KMD с повышенным разрешением дополнительно разрешает изотопные структуры (1^st строки: ¹²С 2^nd строки: ¹³C₁, …) и еще лучше различает шесть серий (3B, Х=84).

Рис. 3. Полномасштабные графики KMD с базой дроби, рассчитанные с базовыми единицами дроби (A) 3HB/85 и (B) 3HB/84 с использованием msRepeatFinder.

Режим группировки с графиком KMD с улучшенным разрешением

«Режим группировки» в msRepeatFinder в сочетании с анализом KMD на основе фракций позволяет маркировать каждую серию ионов в масс-спектре и отображать график с визуальным цветовым кодированием с помощью простого выбора точек (Рис 4). Высокая разделяющая способность, достигаемая с 3HB/84, также позволяет выбирать моноизотопные пики (¹²С, светло-зеленые точки) из основного ряда I (темно-зеленые точки). Невыбранные серии ионов также могут быть скрыты, чтобы дополнительно помочь визуализировать полимерные серии по фоновым пикам.

Рис. 4. (A) График KMD с основанием дроби, рассчитанный с помощью единицы измерения дроби 3HB/84 в режиме группировки для маркировки серии в масс-спектре (B).

Выводы

Анализ KMD становится динамичным с введением «Основы фракций KMD», основанной на методологии с улучшенным разрешением. Это очень универсальный инструмент, поскольку уменьшение или увеличение значения фракции приводит к многочисленным благоприятным разделениям серий ионов, различающихся их изотопным составом, концевыми группами или присоединенным ионом. Он может быть успешно адаптирован к любому типу гомополимеров и любому типу масс-спектральных данных от средней до сверхвысокой точности.

Благодарности

Эти указания по применению написаны на основе результатов совместного исследовательского проекта с Саякой Накамура, Тьерри Фуке и Хироаки Сато из Исследовательского института устойчивой химии Национального института передовых промышленных наук и технологий (AIST).

Рекомендации

[1] С. Накамура, Т. Фуке, Х. Сато. Варенье. соц. Масс-спектр. 2019, 30, 355.
[2] Х. Сато, С. Накамура, К. Терамото, Т. Сато. Варенье. соц. Масс-спектр. 2014, 25, 1346.
[3] Т. Фуке, Х. Сато. Анальный. Химреагент 2017, 89, 2682.
[4] С. Накамура, Р.Б. Коди, Х. Сато, Т. Фуке. Анальная хим. 2019, 91, 2004.