Биологическая электронная микроскопия; Поиск Evermore важных данных для новых открытий в биологических исследованиях

ИНТЕРВЬЮ 08

Роланд Флек
Профессор Королевского колледжа Лондона, Великобритания

Понимание клеточных и молекулярных структур является основной основой биомедицинских исследований. Профессор Роланд Флек, который является директором CUI (Центра ультраструктурной визуализации) в Королевском колледже Лондона, посвятил себя визуализации их структур с высоким разрешением с использованием электронных микроскопов JEOL. Он использует как сканирующие, так и просвечивающие электронные микроскопы, например, JSM-7800FPRIME, JEM-F200, а также другие инструменты JEOL в партнерстве с JEOL. Центр, который является Центром передовых технологий JEOL (JCAT), специализируется как на методах комнатной температуры, так и на методах криоэлектронной микроскопии.

Почему важно понимать сложный биологический процесс.

CUI (Центр ультраструктурной визуализации) в Королевском колледже Лондона под руководством профессора Флека занимается применением передовых методов визуализации с использованием как просвечивающего электронного микроскопа (ПЭМ), так и сканирующего электронного микроскопа (СЭМ) для понимания сложных биологических процессов. «Биологический процесс» охватывает различные виды биологических явлений, в том числе организацию генома, передачу сигналов, развитие клеточного цикла и другие сложные системы.

Человеческое тело имеет разные области, специализированные для разных функций: глаза видят, ноги ходят. Пространственная специализация функций происходит на всех уровнях: внутри глаза клетки хрусталика и фоторецептора по-разному вносят свой вклад в зрение, и разные молекулы, сгруппированные в разных частях каждой клетки фоторецептора, выполняют разные задачи (одни обнаруживают свет, другие сообщают мозгу, что свет обнаружен). ). Однако молекулярный уровень увеличения составляет около 1,000,000 1 1000x. Этого нельзя достичь с помощью обычных световых микроскопов, и для этого требуются микроскопы, использующие более короткую длину волны электронов. Однако электронные микроскопы обычно ограничены просмотром очень тонких образцов ткани, толщиной в XNUMX/XNUMX человеческого волоса, и для содержания одной клетки требуются сотни таких тонких срезов.

Клетки и ткани также необходимо предварительно подготовить к исследованию в электронном микроскопе. Для того, чтобы выполнить эту подготовку, требуется опыт во многих различных областях и исследования, чтобы понять и оптимизировать процедуры подготовки образцов. Профессор Флек стремится улучшить подготовку проб с помощью исследований, чтобы получить более качественную информацию об образце. «Именно в этом контексте сотрудничество с JEOL так ценно», — говорит профессор Флек.

Криопрепарирование биологических тканей.

Биологические ткани состоят из групп клеток. Например, сердце — орган, состоящий из различных тканей (миокард, сосуды, нервы и т. д.) и играющий биологическую роль, причем эти ткани связаны в определенном порядке. Таким образом, понимание морфологии и структуры тканей имеет важное значение.

Криоэлектронная микроскопия позволяет наблюдать за таким образцом ткани, используя низкие температуры для сохранения его «нативного» состояния. Образец охлаждают и выдерживают при очень низких температурах на «крио» столике, установленном на электронном микроскопе. Избегание кристаллического льда при замораживании (витрификации) имеет основополагающее значение для раскрытия разрешающего потенциала криоэлектронной микроскопии. Витрификация позволяет рассматривать структуры в их естественном состоянии, избегая артефактов, обычно связанных с методами химической фиксации и дегидратации, а также ультраструктурных нарушений, связанных с образованием внутриклеточного льда.

Профессор Флек использует множество криотехнологий, каждая из которых направлена ​​на предотвращение образования кристаллов льда при замораживании. Быстрое охлаждение позволяет витрифицировать небольшие объемы за счет использования промежуточного криогена (например, этана или пропана). Это позволяет избежать эффекта Лейденфроста (когда пленка изолирующего пара, создаваемая повышением температуры криогена выше его точки кипения, замедляет охлаждение). Это подход, установленный Жаком Дюбоше (Нобелевская премия по химии в 2017 г.) для витрификации небольших изолированных частиц в виде пленки на сетке ПЭМ для ПЭМ отдельных частиц. Для более толстых образцов целых клеток или тканей используется морозильник высокого давления. Метод замораживания под высоким давлением (HPF) основан на физике воды: давление 2100 бар, применяемое во время замораживания, действует как физический криопротектор; высокое давление противодействует расширению воды при кристаллизации, тем самым замедляя образование кристаллов льда и снижая критическую скорость охлаждения, необходимую для витрификации (10,000 XNUMX °C).-1).

Блоки витрифицированной ткани можно обрабатывать путем замещения замораживанием, делать срезы при криогенных температурах (CEMOVIS) или ломать и непосредственно наблюдать в крио-сканирующем электронном микроскопе или после создания реплики, наблюдаемой в ПЭМ. Профессор Флек использует каждый из этих методов для решения различных вопросов. Например, HPF теперь интегрирован с электрической стимуляцией и световой стимуляцией, что обеспечивает высокий уровень временной корреляции между стимуляцией и иммобилизацией при применении для изучения того, как информация передается от одного нейрона к другому в мозге.

В световой микроскопии флуоресцентные метки используются для отображения белков, ограниченных компартментами в живых клетках, но не дают возможности увидеть основную ультраструктуру. Электронный микроскоп имеет разрешение, позволяющее отображать клеточную ультраструктуру, но не может «видеть» флуоресцентные метки. Вместо этого мечение иммунозолотом используется для визуализации (маркировки) местоположения (локализации) целевых (специфических) клеток и/или тканей с помощью электронного микроскопа с использованием реакций антиген-антитело, когда антитела специфически связываются с антигенными клетками и/или тканями. Для этого метода метод замороженных ультратонких срезов (метод Токуясу) сначала вводит криопротектор (сахарозу) для подавления образования кристаллов льда во время сравнительно медленных скоростей охлаждения, достигаемых путем погружения образца непосредственно в жидкий азот (~ <100°C).-1). Затем ткань разрезают с помощью криоультрамикротомии и метят иммунозолотом.

Рис. 1. Двойное мечение липидных капель в клетке, инфицированной вирусом гепатита С. Два разных размера коллоидного золота используются для маркировки различных белков, представляющих интерес, и показывают, что каждый из них локализован на внутренней мембране липидной капли. Ткань готовили, делали срезы и маркировали с использованием техники Токуясу. Двойная маркировка выделена синим кругом.

Важность понимания клеточных и молекулярных структур с помощью SEM и TEM для паразитологии.

Понимание клеточной и молекулярной структуры малярии необходимо для разработки эффективных противомалярийных препаратов. малярия, Plasmodium тропическойПаразиты развиваются внутри красных кровяных телец (эритроцитов) и содержатся внутри окруженной мембраной паразитофорной вакуоли. Во время своего развития паразит модифицирует поверхность эритроцита, что приводит к ригидности цитоскелета в инфицированных клетках и к передаче на цитоскелет сил сдвига, испытываемых прилипающими клетками. После полного развития происходит многоэтапный процесс, называемый выходом. Для этого паразиты организуют строго регулируемую последовательность этапов пермеабилизации и разрыва мембран, кульминацией которых является взрывное высвобождение паразитов для нового раунда инфекции.

Понимание этих процессов является ключом к открытию жизненного цикла малярии. Для этого исследования полезна электронная томография. Электронная томография — это метод реконструкции трехмерных внутренних структур образца путем компьютерной обработки множества проекционных изображений, полученных из последовательных изображений образца с наклоном. Профессор Флек использует электронную томографию замороженных под высоким давлением, лиофилизированных инфицированных эритроцитов и криоэлектронную томографию витрифицированных призраков эритроцитов для изучения трехмерной модификации поверхности эритроцитов. Высокоорганизованный скелет бугорка, состоящий из спиральной структуры, покрытой электронно-плотным слоем, лежит под мембраной бугорка. Скелет этого бугорка соединен множеством звеньев с цитоскелетом эритроцита. Затем расположение мембранных белков в выступах визуализировали с помощью СЭМ с замораживанием и разрушением с высоким разрешением. Образцы готовили путем замораживания под высоким давлением и замораживания живых паразитов. Мембранные структуры были выявлены с высоким разрешением, а структуры выступов отличались от таковых в окружающей мембране эритроцитов со структурой на вершине, которая, вероятно, представляла собой место адгезии. Таким образом, было показано, что выступы эритроцитов при инфекции P. falciparum содержат высокоорганизованную скелетную структуру, лежащую в основе специализированного участка мембраны.

Рис. 2. Малярия, Plasmodium тропической, паразиты, развивающиеся внутри красных кровяных телец (эритроцитов). Семь мерозоитов содержатся в окруженной мембраной паразитофорной вакуоли. Мерозоиты располагаются вокруг центрального остаточного тела. В результате процесса разрушения обнажается множество отдельных оболочек.

Трехмерная реконструкция с использованием SEM серийного блока

Изучение мозга имеет решающее значение, поскольку выявление связей нервных клеток в мозге ведет к пониманию механизмов обучения и памяти. Целью является анализ коннектома, направленный на выявление всех связей между всеми нервными клетками в головном мозге. Для визуализации этих связей ПЭМ позволяет наблюдать связи между нейронами, но наблюдаемая область очень тонкая и ограниченная. «Поэтому в этом случае очень эффективен последовательный блочный SEM (SBF-SEM)», — отмечает профессор Флек.

Серийный СЭМ с поверхностью блока (SBF-SEM) — это метод реконструкции трехмерной (3D) структуры блока образца с помощью СЭМ. Этот метод в основном используется для 3D-реконструкции мягких материалов, таких как залитые смолой нейроны «мозговой» ткани. Блочный образец ткани головного мозга нарезают толщиной ~ 30 нм до объема > 500 мкм от поверхности с помощью ультрамикротома, встроенного в камеру для образцов СЭМ, а затем наблюдают каждую грань, обнаженную при срезе. Собранные изображения складываются для получения трехмерной структуры блока образца.

Зарядка образцов во время SBF-SEM может ограничить качество полученных данных для улучшения проводимости блока ткани, поэтому используется метод OTO (тетроксид осмия-тиокарбогидразид-тетроксид осмия). Этот протокол усиливает контрастность липидов, задолго до SBF-SEM. Профессор Флек использует SBF-SEM и адаптирует и модифицирует эти старые методы обработки, чтобы обеспечить равномерное окрашивание по всему блоку ткани, без опасности больших преципитатов, которые дают сильный сигнал обратного рассеяния и высокую проводимость в SBF-SEM. Используя эту технику, профессор Флек нанес на карту распределение структуры пресинаптических окончаний в СА1. восточный слой, область гиппокампа, которая получает упорядоченные аксональные входы. Стеки данных из нескольких областей были реконструированы, и с помощью эталонных маркеров в ткани данные коррелировали с синаптическими входами, определенными сотрудниками. Хотя дендритные сегменты показали широкое распределение по размеру возбуждающих входов, была сильная корреляция между морфологическими показателями пресинаптических и постсинаптических компартментов. Пресинаптические бутоны, формирующиеся на базальных дендритах пирамидных нейронов СА1, обнаруживают уменьшение размера активной зоны (АЗ) по мере удаления от сомы. Это обеспечивает зависящее от расстояния увеличение кратковременного облегчения (функции). Таким образом, пространственное распределение кратковременного облегчения, модулированное морфологией, служит для компенсации электротонического затухания подпороговых дистальных входов во время повторной стимуляции и точной настройки предпочтительной входной частоты дендритных доменов.

Корреляционная световая и электронная микроскопия (CLEM) для объединения оптического микроскопа и электронного микроскопа

Этот метод (CLEM) использует уникальное сочетание возможностей оптического микроскопа и электронного микроскопа. Он используется для первоначальной идентификации белков или тканей с помощью флуоресцентного микроскопа, при котором белки или ткани подвергаются флуоресцентному окрашиванию (маркировке), а затем для наблюдения за морфологией или структурой идентифицированных областей-мишеней с использованием электронного микроскопа с высоким пространственным разрешением. CLEM широко используется в биологических науках, с помощью которых можно проводить анализ функций и тонкой морфологии (структуры) меченых белков или тканей. CLEM можно комбинировать с электронными микроскопами TEM или SEM, а с добавлением специальных криогенных столиков можно поддерживать корреляцию между флуоресцентными и крио-ЭМ-инструментами высокого разрешения. В CUI есть несколько рабочих процессов CLEM. К ним относится рабочий процесс Nikon to JEOL SEM при комнатной температуре, когда клетки выращивают на специальной чашке для культивирования тканей, которая поддерживает визуализацию живых клеток. Эти чашки для тканевых культур обеспечивают корреляцию между клеточным процессом и визуализацией в SEM после обработки образцов при комнатной температуре.

Центр передовых технологий JEOL для дальнейшего развития наук о жизни

Сочетание подходов криоэлектронной микроскопии и структурной биологии для определения трехмерных клеточных структур «на месте» из срезов витрифицированных клеток и тканей является новым рубежом для клеточной биологии. Для этого требуется не только крио-ТЭМ, но и инструменты для криофиксации и крио-срезов. Это включает в себя оптимизацию новейшего СЭМ с фокусированным ионным пучком (FIB-SEM) от JEOL JIB-3F для использования подготовки ламелей стекловидного тела FIB и переноса без загрязнения в крио-ТЭМ.

Профессор Флек говорит: «Биологическая электронная микроскопия добилась значительного прогресса за последнее десятилетие. Теперь мы будем стремиться решать новые задачи в тесном сотрудничестве с JEOL. У нас есть много-много идей для обмена и предложений по разработке передовых инструментов. Я рад быть частью этих будущих инноваций».

Центр передовых технологий JEOL (JCAT) также играет важную роль в развитии общества. JCAT предоставляет местным больницам различные технологии для диагностики заболеваний почек, кожи и т. д. Камера JEOL RUBY, установленная на JEOL JEM-1400Plus, очень эффективна для проведения биопсии и проста в эксплуатации.
Профессор Флекс подчеркивает: «JCAT, созданная на основе партнерства с JEOL, станет важной платформой, на которой будут рождаться новые идеи инструментов и методов благодаря нашим конструктивным отношениям сотрудничества, что приведет к дальнейшему развитию исследований в области наук о жизни».

Размещено: март 2019 г.

Просвечивающие электронные микроскопы (ПЭМ, TEM)