Объемная ЭМ ~ 3D реконструкция ~

Это метод наблюдения и анализа внутренней структуры образца с использованием 3D-реконструкции с использованием электронных микроскопов. Существует два метода 3D-наблюдения с использованием электронных микроскопов: первый метод — это метод 3D-реконструкции, который складывает последовательно полученные изображения поперечного сечения (матричная томография, последовательная грань блока, FIB-SEM), а другой метод — это 3D-реконструкция путем вычислений из проекционных изображений образца при непрерывных наклонах (TEM-томография).

Подробную информацию о каждой технике можно посмотреть здесь.

Матричная томография

Матричная томография обеспечивает трехмерную информацию об образцах, таких как биологические ткани. Образец, залитый смолой, разрезается на серийные срезы. Те же положения срезов наблюдаются с помощью сканирующего электронного микроскопа (СЭМ) для создания стопки изображений, которая используется для трехмерной реконструкции.

Рабочий процесс томографии с использованием массива

Серийный блок лицевой поверхности (SBF)

Поверхность биологического образца, залитого в смолу, разрезается алмазным ножом и наблюдается с помощью СЭМ. Повторяя разрезание и наблюдение, можно получить серию изображений СЭМ в направлении толщины. Трехмерная реконструкция выполняется путем наложения этой серии изображений СЭМ. Далее, извлечение (сегментация) целевого объекта (целых клеток, органелл и т. д.) выявляет трехмерную структуру в диапазоне сотен мкм.
Резку и наблюдения можно выполнять автоматически с помощью специализированного устройства для резки, встроенного в камеру для образцов СЭМ.

* Deerinck, TJ, Bushong, E., Thor, A. и Ellisman, MH Методы NCMIR для 3D ЭМ: новый протокол подготовки биологических образцов для серийной СЭМ с гранями блоков. Микроскопия (Oxf), 6-8. (2010)

Рабочий процесс резки и наблюдения

Метод FIB-SEM 3D-реконструкция

Поперечное сечение с помощью FIB и получение изображения SEM выполняются последовательно. 3D-реконструкция выполняется путем наложения последовательных поперечных сечений изображений SEM. Этот метод требует, чтобы образцы были окрашены мощными тяжелыми металлами и залиты в смолу. Преимуществами этого метода являются высокая точность позиционирования, небольшие искажения из-за обработки, высокое разрешение резки (менее 20 нм) и возможность резать твердые материалы, такие как зубы, кости и металлические имплантаты, которые трудно резать алмазным ножом.

ТЭМ-томография

Толщина образцов, наблюдаемых с помощью ПЭМ, составляет 100 нм или менее, но внутри них имеются тонкие структуры, меньшие толщины образца. 3D-реконструкция с помощью метода томографии ПЭМ позволяет реконструировать 3D-структуры внутри образца с высоким разрешением путем расчета с использованием проекционных изображений, полученных при непрерывных наклонах образца.