CLEM для науки о жизни
Что такое КЛЕМ
CLEM (Коррелятивная световая и электронная микроскопия) — это метод эффективного наблюдения и анализа путем объединения информации об одном и том же образце, полученной с помощью светового микроскопа (LM) и просвечивающего электронного микроскопа (TEM) или сканирующего электронного микроскопа (SEM). Преимущества обоих могут быть использованы при этом для наблюдения и анализа.
Нажмите здесь и ознакомьтесь с каждым методом CLEM для естественных наук.
полировка CLEM / фрезерование CLEM
Это метод наблюдения того же поля зрения, что и LM-изображение (оптическое изображение) с помощью сканирующего электронного микроскопа, экспонируя его на поверхности путем полировки или ионного фрезерования и т. д. Можно наблюдать все изображение или флуоресцентное окрашивание изображения клеток с помощью LM, а затем наблюдать детальную структуру внутри клетки с помощью SEM. Возможность простого и обширного наблюдения является особенностью. Использование специализированного держателя звеньев позволяет легко выровнять положение.
Рабочий процесс польского CLEM / фрезерного CLEM
Клетки культивируются на чашке с маркером, предварительно фиксируются и окрашиваются. После наблюдения LM образец препарата прикрепляется к держателю, и координаты подтверждаются. Поверхность наблюдения экспонируется полировкой и ионным фрезерованием и наблюдается с помощью SEM.
Примеры применения, для которых подходит эта техника
- Наблюдение за структурой внутри клетки
- Широкое поле зрения наблюдения
- Многоточечное наблюдение
на чипе CLEM
Это метод наблюдения сверхтонкого образца на одном и том же креплении образца (чип окна SiN) с использованием как светового микроскопа (LM), так и просвечивающего электронного микроскопа (TEM). Поскольку нет процесса, вызывающего деформацию образца между наблюдениями с помощью LM и TEM, возможно высокоточное наложение. Этот метод также может быть использован для области материалов.
рабочий процесс CLEM на чипе
CLEM на чипе заключается в том, чтобы поместить ультратонкий срез образца, подготовленный для TEM, на чип окна SiN. Чип окна SiN можно прикрепить к держателям для светового микроскопа и TEM с помощью специального фиксатора. Переключив использование специального фиксатора на держатель LM и держатель TEM, можно легко выполнять наблюдение LM・TEM.
Поскольку можно наблюдать одни и те же участки, можно получить высокоточные корреляции.
Примеры применения, для которых подходит эта техника
- Образец, в котором можно наблюдать флуоресценцию или особый рассеянный свет после приготовления ультратонкого среза
- Образец, в котором можно проводить наблюдение за разностью фаз
- Частицы тонера (с автофлуоресценцией) или кристаллического полимера и т. д.
кроме биологического образца
LLP-CLEM
Limitless Panorama (LLP) имеет функцию импорта изображений, полученных извне, например, с помощью светового микроскопа. LLP может сопоставлять область наблюдения LLP с координатами образца просвечивающего электронного микроскопа. После сопоставления координат каждого изображения наблюдения с помощью ПЭМ делаются монтажные снимки области, которая наблюдалась с помощью LM. Можно наблюдать широкий диапазон с высоким разрешением.
Рабочий процесс LLP-CLEM
Клетки, культивируемые на чашке с маркерами, предварительно фиксируются и окрашиваются. После получения изображения LM целевая область образца после постфиксации и заливки смолой вырезается с использованием маркера в качестве ориентира. Ультратонкий срез образца готовится с помощью ультрамикротома и наблюдается с помощью TEM.
Выравнивание выполняется путем указания трех или более общих точек между полученным изображением LM и изображением TEM изображения с малым увеличением. Укажите область и выполните визуализацию LLP.
Примеры применения, для которых подходит эта техника
- Широкое поле зрения наблюдения
- Поиск небольшого количества мутантных клеток и т.д.
В смоле CLEM
В смоле CLEM — это метод подготовки ультратонкого среза после флуоресцентного окрашивания и заливки образца смолой, оживления флуоресценции и наблюдения того же среза с помощью светового микроскопа и электронных микроскопов (TEM/SEM). Для оживления флуоресценции используется возбудитель флуоресценции (раствор TUK). Один и тот же срез можно наблюдать как с помощью светового, так и электронного микроскопа, что позволяет с высокой точностью накладывать оптические и электронно-микроскопические изображения.
Рабочий процесс CLEM в смоле
Сверхтонкий срез монтируется на чипе окна SiN (для TEM) или пластине Si или предметном стекле (для SEM), которые имеют гладкую поверхность. Наносится флуоресцентный восстановитель (раствор TUK) и наблюдается с помощью светового микроскопа, а затем электронного микроскопа.
Примеры применения, для которых подходит эта техника
- Флуоресцентный белок, флуоресценцию которого можно восстановить с помощью возбудителя флуоресценции, а также культивируемые клетки и ткани, в которые возможно введение флуоресцентных красителей.
- Образец, требующий очень точного выравнивания, например локализации белков в органелле.
Многоцветный CLEM
Возможны различные модификации с органическими наночастицами кремния, такие как смешивание флуоресцентных красителей или добавление тяжелых металлов. Органические наночастицы кремния с флуоресцентными красителями и тяжелым металлом попадают в клетки. Органические наночастицы кремния с несколькими видами тяжелых металлов можно отличить по добавленному тяжелому металлу с помощью картирования EDS. Таким образом, его можно наблюдать в нескольких цветах не только с помощью световых микроскопов, но и с помощью электронных микроскопов. Это также можно использовать в качестве маркировки, когда область, наблюдаемая с помощью флуоресцентного микроскопа, подробно наблюдается с помощью электронного микроскопа.
Многоцветный рабочий процесс CLEM
Органические наночастицы кремния модифицируются, например, «зеленая флуоресценция + золотая частица» и «красная флуоресценция + железная частица». Это вводится в культивируемую клетку, а затем подтверждение той же области становится возможным с помощью флуоресцентного наблюдения и картирования EDS.
Примеры применения, для которых подходит эта техника
- Клетки макрофагального типа, фагоцитирующие наночастицы кремния
- Микроорганизмы, питающиеся наночастицами кремния, такие как парамеции и амебы
- Маркировка возможна для ячеек в естественных условиях через внутривенные инъекции
Введение в сопутствующие товары
Оконный чип SiN
Высокопрочная пленка SiN позволяет нам наблюдать последовательно большую область размером в миллиметр. Он также идеально подходит для наблюдения за последовательно нарезанными срезами, поскольку в нем нет невидимой области, которая возникает при использовании обычных сеток ПЭМ. Специальный фиксатор упрощает проведение корреляционной световой и электронной микроскопии (CLEM).
Нажмите кнопку ниже, чтобы вернуться на ГЛАВНУЮ страницу раздела Биология / Науки о жизни