Анализ состава и структуры меченых N-связанных гликозидов с использованием масс-спектрометра JMS-S3000 NewSpiralTOF™
MSTips № 519
Введение
N-связанные гликозиды представляют собой посттрансляционные модификации, в которых N-ацетилглюкозамин (GlcNAc) присоединяется к остаткам аспарагина в белках. Они играют важную роль в структуре и функции белков и участвуют в биологических процессах, таких как передача сигналов и иммунные реакции. Структурные изменения в N-связанных гликозидах тесно связаны с различными заболеваниями и привлекают внимание как биомаркеры, особенно при раке и врожденных нарушениях гликозилирования. Поэтому точный структурный анализ N-связанных гликозидов важен как для фундаментальных исследований, так и для клинического применения. В данной статье представлены результаты точных измерений массы в режиме SpiralTOF и структурного анализа в режиме TOF-TOF, полученные с помощью меченых N-связанных гликозидов (рис. 1).
Способ доставки
2,5-Дигидроксибензойная кислота (ДГБ; FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) использовалась в качестве матрицы в концентрации 10 мг/мл в 50%-ном водном растворе ацетонитрила и 0.1% трифторуксусной кислоты. В качестве аналита использовался 50 пмоль/мкл водный раствор меченого N-связанного гликана 3-G1 2AB (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.). Растворы образца и матрицы (по 0.5 мкл каждый) наносились на мишень и высушивались на воздухе для образования сокристаллов. Точные измерения массы проводились в режиме SpiralTOF, после чего проводился структурный анализ в режиме TOF-TOF (оба в режиме положительных ионов). Меченый N-связанный гликан 3-G1 2AB состоит из N-ацетилглюкозамина (GlcNAc), маннозы (Man) и галактозы (Gal).
Рис. 1. Структура меченого N-гликана 3-G1 2AB (a) и символическая номенклатура гликанов (b)
Результат
Результаты измерений в режиме SpiralTOF
Результаты, полученные с использованием режима SpiralTOF, показаны на рис. 2. Меченый N-связанный гликан 3-G1 2AB наблюдался в виде иона аддукта натрия (рис. 2-а). Наблюдаемый пик демонстрировал разрешающую способность по массе более 70 000. Далее были проведены точные измерения массы с использованием ангиотензина I (AngI) и фрагмента адренокортикотропного гормона 1–17 (человек, крыса; АКТГ 1–17) в качестве внутренних стандартов (рис. 2-б). Измеренная масса меченого N-связанного гликана 3-G1 2AB составила 1621.5982, что указывает на погрешность массы +0.9 мДа относительно расчетного значения 1621.5973. На рисунке 3 показана изотопная картина иона аддукта натрия меченого N-связанного гликана 3-G1 2AB. Наблюдаемая изотопная картина точно соответствовала теоретическому распределению изотопов.
Рис. 2. Масс-спектры меченого N-гликана 3-G1 AB (a) и меченого N-гликана 3-G1 2AB с пептидной смесью (b).
Рис. 3. Сравнение теоретической изотопной картины (а) и полученной изотопной картины (б).
Результаты измерений в режиме TOF-TOF
Спектр ионов-продуктов, полученный из м / г На рисунке 4 показано значение 1621.6 в режиме TOF-TOF. Наблюдение пика при м / г 23 подтверждает, что обнаруженный ион меченого N-связанного гликана 3-G1 2AB действительно является ионом аддукта натрия. Кроме того, характерные ионы X (▼) такие как м / г 392, 595 и 1122, а также ионы Y (▼) такие как м / г Были четко обнаружены ионы 364, 567 и 1093, в которых заряд сохраняется на восстановительном конце гликана. Ионы X образуются в результате расщепления внутри сахарного кольца и дают характерные ионы-продукты, которые сохраняют атомы кислорода, содержащиеся в структуре кольца. В отличие от них, ионы Y образуются в результате расщепления гликозидных связей и, как известно, отражают структуру основной цепи гликана. Из наблюдаемых ионов Y были получены ионы-продукты, образовавшиеся из GlcNAc (■), манноза (Man, ●), и галактоза (Gal, ●) были подтверждены. На основании этих результатов были четко идентифицированы составляющие моносахариды меченого N-связанного гликана 3-G1 2AB.
Рис. 4. Спектр ионов-продуктов меченого N-гликана 3-G1 2AB и предлагаемые варианты присвоения.
Заключение
Меченые N-связанные гликоны анализировались методом MALDI-TOFMS. В режиме SpiralTOF целевые пики наблюдались с высокой точностью измерения массы. Кроме того, в режиме TOF-TOF четко наблюдались ионы X и Y, полученные из кольцевой структуры гликона, что позволило идентифицировать составляющие моносахариды. На основании этих результатов было продемонстрировано, что прибор JMS-S3000 способен проводить как композиционный, так и структурный анализ гликонов.
Решения по областям применения
Сопутствующие продукты
Вы медицинский работник или персонал, занимающийся медицинским обслуживанием?
Нет
Напоминаем, что эти страницы не предназначены для предоставления широкой публике информации о продуктах.