Объединение JMS-S3000

Времяпролетная масс-спектрометрия с лазерной десорбцией и ионизацией с матрицей (MALDI-TOFMS) может обнаруживать однозарядные ионы в широком диапазоне масс, что делает ее мощным инструментом для структурного анализа полимеров, такого как подтверждение распределения молекулярной массы и оценка состава концевых групп. Однако при анализе полимеров с высокой полидисперсностью проблемой является «дискриминация по массе», при которой интенсивность ионов в диапазоне высокой молекулярной массы уменьшается из-за различных факторов. С другой стороны, эксклюзионная хроматография (SEC) может разделять полимеры по молекулярной массе, но при этом сложно идентифицировать концевые группы. Поэтому известно, что фракционирование полимеров с высокой полидисперсностью в соответствии с их распределением молекулярной массы с помощью SEC, снижение полидисперсности и последующая характеристика каждой фракции с помощью MALDI-TOFMS являются эффективными. В этом отчете мы провели анализ конечных групп полимерных образцов с высокой полидисперсностью и молекулярной массой менее 50,000 10,000 путем объединения SEC и высокопроизводительной MALDI-TOFMS. В частности, мы сообщаем о (i) улучшении эффективности фракционирования с помощью SEC и предварительной обработки для измерения MALDI-TOFMS, (ii) улучшении визуализации изменений конечных групп в масс-спектрах фракционированных SEC образцов с пониженной полидисперсностью, (iii) анализе конечных групп в области высокой молекулярной массы (молекулярная масса от 20,000 XNUMX до XNUMX XNUMX).

Базовые приготовления

Смесь двух типов поликапролактона (PCL) с различными концевыми группами была приготовлена с концентрацией 1.0 мг/мл каждый. Фракционирование методом SEC выполнялось путем инъекции 100 мкл раствора образца в условиях, указанных в таблице 1. Элюат из SEC фракционировался в стеклянные эко-чашки (Frontier Laboratories) с использованием LC-CollectIR (ST Japan). В этой системе элюат распылялся азотным газом из сопла при 100 °C, а растворитель испарялся во время фракционирования. Для MALDI-TOFMS количество раствора образца, которое можно использовать в одном измерении, составляет около 10 мкл или меньше. Испаряя растворитель во время фракционирования, больше не нужно концентрировать элюат, что позволяет сократить время подготовки. Кроме того, поскольку растворитель испаряется во время фракционирования, можно увеличить количество образца путем многократного фракционирования. В этом случае фракционирование проводилось три раза. Для подготовки образца для измерений MALDI-TOFMS в эко-чашку добавляли 10 мкл ТГФ в качестве раствора фракции. Смешивали 1 мкл раствора фракции и 10 мкл раствора матрицы (использовался DCTB), и 1 мкл смеси капали на мишень и высушивали. Раствор катионизирующего агента (NaTFA) капали на пластину и предварительно высушивали. После этого измерения проводили с помощью JMS-S3000 в режиме Spiral positive-ion. Оставшуюся часть анализа масс-спектров по методу Кендрича (RKM) проводили с помощью msRepeatFinder.

Таблица 1. Условия измерения SEC

Элюент	ТГФ
Детектор	Дифференциальный рефракционный детектор
Column	TSKgel GMH_HR-Н (30 см) × 2 (ТОСОГ)
Расход	1 мл / мин

Результаты

На рисунке 1 и в таблице 2 показаны результаты фракционирования смеси PCL на шесть фракций с помощью SEC. Черная линия на рисунке 1 — это хроматограмма SEC до фракционирования. Затем шесть фракций, фракционированных с помощью SEC, снова подверглись измерению SEC для получения веса полимера (мкг), среднечисловой молекулярной массы и средневесовой молекулярной массы для каждой фракции. Полидисперсность (D) каждой фракции оказалась небольшой, около 1.1 или меньше.

Рисунок 1

Рисунок 1 Хроматограммы SEC до и после фракционирования

Таблица 2 Информация о фракции SEC № 1-6

Дробь Номер регистрации	Сумма (Мкг)	Mn	Mw	D
1	6.4	48,233	50,457	1.05
2	74.4	24,438	26,100	1.07
3	107.4	12,722	13,477	1.06
4	46.3	6,691	7,019	1.05
5	8.9	3,439	3,612	1.05
6	1.5	559	624	1.12
Всего	245

На рисунке 2 показан масс-спектр смеси PCL до фракционирования SEC и масс-спектры шести фракций SEC. Из масс-спектров фракций № 1 и № 6 было подтверждено, что PCL элюируется в порядке от высокой к низкой молекулярной массе. Во фракции № 1 компоненты выше м / г 30,000 были обнаружены, которые не наблюдались до фракционирования, и было обнаружено, что эффект дискриминации масс был снижен. Кроме того, было проведено сравнение между увеличенным спектром масс фракции № 2 около м / г 15,000 и моделирование изотопного рисунка, и они были найдены, чтобы хорошо соответствовать. Разделение изотопного рисунка было подтверждено до примерно м / г 20,000 1. С другой стороны, хотя изменение распределения молекулярной массы можно легко увидеть, упорядочив масс-спектры, трудно понять изменение концевой группы из-за молекулярной массы. Поэтому масс-спектры фракций № 6–114.143 были преобразованы в графики RKM (базовая единица 3u) (рисунок 1). В этом случае интенсивности ионов были нормализованы с использованием информации о весе полимера для каждой фракции, полученной из результатов фракционирования SEC (таблица XNUMX). В результате стало легче понять, что в области низкой молекулярной массы основными компонентами являются циклические олигомеры (серия A), тогда как по мере увеличения массы двумя компонентами с общим элементным составом обеих концевых групп являются C₄H₁₀О (серия В) и С₄H₁₀O₃ (серия C) становятся основными компонентами. Здесь итоги обеих конечных групп серий B и C были получены из точного анализа масс в м / г 2000 регион.

Рисунок 2 Масс-спектры ПКЛ до и после фракционирования SEC.

Рисунок 3 График RKM фракции SEC № 1-6.

Наконец, мы проверили, возможен ли анализ конечных групп с использованием точной массы в диапазоне молекулярной массы более 10,000 4. На рисунке 2 показано изменение ошибки массы (ppm), когда самокалибровка проводилась с использованием серии B, полученной во фракции № 12,000. Для калибровки использовались наиболее распространенные пики, поскольку моноизотопные пики не могут наблюдаться в этой области масс. Ошибки массы в молекулярной массе от 24,000 10 до 20 XNUMX обычно находились в пределах двух ppm, что соответствует ошибке массы примерно от XNUMX до XNUMX мДа. Этот результат считается разумным, поскольку ошибка массы времяпролетного масс-спектрометра не зависит от диапазона масс, если она выражена в единицах ppm. Далее, увеличенный вид области вокруг м / г 15,000 5 показано на рисунке XNUMX. Серии B и C в основном наблюдались в масс-спектре, и их различия в массах соответствуют O₂. Ошибки наиболее распространенных пиков двух серий составили 32.003 а.е.м., 31.990 а.е.м. и 31.991 а.е.м. Сравнение с точной массой O₂ (31.990 а.е.м.) показывает достоверность результатов на рисунке 4. Как описано выше, трудно обнаружить моноизотопные пики в диапазоне масс, превышающем молекулярную массу 10,000 XNUMX, поэтому используются точные массы наиболее распространенных пиков и изотопные паттерны. Предполагается, что можно оценить структуру терминальной группы.

Заключение

Подготовка образца SEC-MALDI стала более эффективной за счет использования аппарата, который многократно фракционирует фракции из SEC при испарении растворителя. Сочетание SEC с MALDI-TOFMS может снизить эффект дискриминации по массе в области высокой молекулярной массы. Кроме того, масс-спектр каждой фракции отображался на графике RKM, который визуализировал изменение концевых групп в соответствии с молекулярной массой. Используя наиболее распространенный пик изотопного рисунка, полученный с помощью MALDI-TOFMS высокого разрешения "SpiralTOF™-plus 3.0", также была продемонстрирована возможность анализа концевых групп в диапазоне молекулярной массы от 10,000 20,000 до XNUMX XNUMX.