Качественный и количественный анализ органических кислот в моче методом газовой хроматографии-масс-спектрометрии высокого разрешения с жесткой и мягкой ионизацией

Введение

Исследование органических кислот мочи является важным компонентом исследования наследственных заболеваний обмена веществ, таких как врожденные нарушения обмена веществ. Моча содержит множество органических кислот, которые образуются из различных источников, включая нормальный и аномальный метаболизм, лекарства и метаболизм лекарств или даже ксенобиотики и пищевые добавки. Для анализа органических кислот мочи обычно выбирают газовую хроматографию-масс-спектрометрию (ГХ-МС), особенно ГХ-одинарный квадрупольный МС (ГХ-КМС). Однако, поскольку GC-QMS не имеет возможности точно идентифицировать органические кислоты в моче из-за ее сложной смеси, особенно при создании нового метода, вместо этого более квалифицированной системой является GC-MS высокого разрешения (GC-HRMS).

JMS-T2000GC, система ГХ-HRMS, которая включает в себя комбинированный источник ионов с электронной ионизацией (EI) и полевой ионизацией (FI), способна переключаться между режимами EI и FI без нарушения вакуума. Анализ данных, полученных двумя методами ионизации с помощью программного обеспечения msFineAnasis AI, приводит к оценке химических структур, а также составов, что практично для определения соединений в органических кислотах. 

В данной работе был выполнен качественный анализ химического состава и структуры органических соединений мочи, а также количественный анализ целевой органической кислоты с использованием JMS-T2000GC с msFineAnalysis AI.

Измерения

Органические кислоты в виде растворов проб экстрагировали из подкисленной мочи методом жидкостно-жидкостной экстракции этилацетатом с последующей дериватизацией триметилсилила (ТМС) для повышения летучести органических кислот. Затем 1 мкл раствора образца вводили в JMS-T2000GC с помощью автосамплера. Программное обеспечение msFineAnasis AI использовалось для качественного анализа, а программное обеспечение Escrime™ — для количественного анализа. Подробные условия измерения ГХ-HRMS представлены в таблице 1.

JMS-T2000GC «AccuTOF™ GC Альфа»

Таблица 1. Условия измерения

ГХ-HRMS	JMS-T2000GC (ООО «ДЖЕОЛ»)
Режим входа ГХ	без разделения
Температура на входе ГХ	280 ° C
Колонка ГХ	ДБ-5МС, 30 м х 0.25 мм, 0.25 мкм
ГХ Духовка	60°C (1 мин) →10°C/мин →300°C (3 мин)
Газ-носитель	Он, 1.0 мл/мин
МС-ионизация	ЭИ+: 70 эВ, 300 мкА FI+: -10 кВ с эмиттером JEOL 5 мкм (10 мА, 6 мс)
MS Monitor ионный диапазон	м / г 45-800
Программное обеспечение для анализа	Качественный: msFineAnaанализ AI (JEOL Ltd.) Количественный: Escrime™ (JEOL Ltd.)

Рисунок 1. TICC органической кислоты мочи из образца (вверху: EI, внизу: FI)

Результаты качественного анализа

На рисунке 1 показаны хроматограммы общего ионного тока (TICC) органических кислот мочи из образца как EI, так и FI, в результате чего было обнаружено 108 соединений, включая 29 целевых органических кислот, результаты анализа msFineAnlaysis AI которых показаны в красных столбцах в таблице 2. Пик [33] отнесен к триметилсилиловому эфиру 5-метил-3-изоксазолпропановой кислоты, производному ТМС из оксимированного сукцинилацетона. Однако некоторые совместно элюированные компоненты из-за невозможности хроматографического разделения, такие как пики [023] и [024], были обнаружены отдельно с помощью функции деконволюции msFineAnaанализ AI. 

Результаты как комплексного анализа, так и структурного анализа AI пика[098], полученные с помощью msFineAnalysis AI, показаны на рисунках 2 и 3 соответственно. Молекулярный ион не был обнаружен в масс-спектре ЭУ на рисунке 2, тогда как [M+H]⁺ ион был обнаружен в масс-спектре ФВ, что указывает на важность комбинированного анализа методов мягкой ионизации. Химическая формула была оценена как C₁₆H₃₄НЕТ₅Si₂ от точной массы обнаруженного [M+H]⁺ ион, который не соответствовал предполагаемому химическому составу молекулярного иона или соединению-кандидату из результатов поиска в базе данных NIST. Однако msFineAnalysis AI получила библиотеку AI, содержащую множество масс-спектров ЭУ соединений, которые не зарегистрированы в базе данных NIST, а в качестве кандидатов были показаны соединения, которые соответствуют химическому составу, оцененному по молекулярному иону, и имеют соответствующую структуру ионов фрагмента ЭУ. в результатах поиска библиотеки AI (рис. 3). 

Рисунок 2. Результаты комплексного анализа пика 098.

Рисунок 3. Результаты структурного анализа AI пика 098.

Табл. 2. Результаты msFineAnaанализ AI

Результаты количественного анализа

На рисунке 4 показаны EI TICC и хроматограммы экстрагированных ионов (EIC) трех целевых органических кислот: 2TMS-молочной кислоты, 2TMS-гликолевой кислоты и оксима 2TMS-пировиноградной кислоты. Множественные пики были обнаружены в TICC для сложных компонентов мочи. Однако EIC, созданные точным м / г сигналу удается обнаружить целевое соединение, ограничивая при этом влияние других соединений до минимума.
Все органические кислоты, включая совместно элюированные органические кислоты, демонстрируют различимую форму пиков для количественного анализа (частично представлены на рисунке 4). В качестве примера количественного анализа количественные значения целевых органических кислот в нескольких образцах мочи, приведенные в таблице 3, были рассчитаны на основе соотношения площадей с эталонными образцами при известных концентрациях.

Таблица 3. Количественные значения целевых органических кислот (Единица измерения: мкМ)

Рисунок 4. TICC и EIC извлеченного образца мочи.
(Справа: 2TMS-молочная кислота, В центре: 2TMS-гликолевая кислота, слева: оксим 2TMS-пировиноградной кислоты)

Резюме

JMS-T2000GC с msFineAnalysis AI — мощный инструмент для идентификации химического состава и химической структуры таких компонентов, как ТМС-производные органических кислот в моче, а также для количественного анализа с помощью EIC, которые создаются точными м / г. Ожидается, что JMS-T2000GC с msFineAnalysis AI в будущем будет иметь широкий спектр приложений для метаболомики и клинического анализа. 

Решения по областям применения

Биология / Науки о жизни

Сопутствующие продукты

JMS-T2000GC Высокопроизводительный газовый хроматограф AccuTOF™ GC-Alpha — времяпролетный масс-спектрометр

msFineAnalysis AI Ver.2 Программное обеспечение для анализа структуры неизвестных соединений

Категория продукта

Газовые хроматографы с масс-спектрометром (GC-MS)