Нецелевой анализ метаболитов саке с использованием газового хроматографа - времяпролетного масс-спектрометра (GC-TOFMS)

Введение

Саке — японский алкогольный напиток, приготовленный в основном из риса, коме-кодзи и воды. Помимо алкоголя, саке содержит аминокислоты, органические кислоты и сахара, которые придают ему разнообразные вкусы и ароматы. Саке также классифицируется как «Дайгиндзё-сю», «Дзюнмай-сю» и «Хондзозо-сю», в зависимости от степени полировки риса и от того, добавлен ли дистиллированный спирт или нет, а другие виды сакэ классифицируются как «фуцу-сю». '¹⁾. Считается, что аминокислоты, органические кислоты и сахара в сакэ возникают в результате метаболизма микроорганизмов, таких как коме-кодзи и дрожжи. Следовательно, возможно классифицировать эти типы саке с помощью метаболомного анализа.
Газовый хроматограф-масс-спектрометр (ГХ-МС) широко применяется в метаболомике благодаря богатой базе данных, простоте эксплуатации и высокой воспроизводимости измерений. Объектами измерения ГХ-МС являются летучие соединения. Однако процессы дериватизации, такие как триметилсилилирование, можно использовать для измерения высокополярных метаболитов, таких как сахара и аминокислоты. Кроме того, в области метаболомики иногда выявляют «неизвестные соединения», не зарегистрированные в библиотечной базе данных (БД). В этом случае молекулярную формулу даже неизвестного соединения можно определить, используя времяпролетный масс-спектрометр (TOFMS) в качестве масс-спектрометра и проводя «комплексный анализ», сочетающий в себе электронную ионизацию и мягкую ионизацию.²⁾. Кроме того, с помощью программного обеспечения для автоматического анализа структуры под названием «msFineAnalysis AI», которое использует искусственный интеллект (ИИ) для прогнозирования массовых спектров ЭУ на основе химических структур, можно оценить структурную формулу³⁾.
В этом MSTips мы сообщим о результатах нецелевого анализа метаболитов в саке с использованием газовой хроматографии и времяпролетной масс-спектрометрии (GC-TOFMS).

Экспериментальный

Дериватизация

В качестве образцов были использованы четыре вида сакэ, относящиеся к разным коммерческим классификациям (Дайгиндзё-сю, Дзюнмай-сю, Хондзозо-сю и Нигори-сю). О Нигори-шу центрифугировали (4 ℃, 10 мин, 12,000 об/мин), и в качестве образца использовали только надосадочную жидкость. Мы также подготовили образец для проверки качества (КК), в котором все образцы были смешаны в равных количествах. К 20 мкл каждого образца добавляли 10 мкл раствора синапиновой кислоты в метаноле с концентрацией 1 мг/мл в качестве внутреннего стандарта и перемешивали. Далее их сушили в испарителе и оставляли на ночь в эксикаторе. На следующий день к каждому образцу добавляли 100 мкл раствора пиридина гидрохлорида метоксиамина с концентрацией 20 мг/мл и встряхивали термошейкером (30 ℃, 90 мин, 1200 об/мин). После этого добавляли 50 мкл N-метил-N-(триметилсилил)трифторацетамида (MSTFA), смесь нагревали и снова встряхивали термошейкером (37 ℃, 30 мин, 1200 об/мин).

ГХ-МС измерение

Для измерения использовали ГХ-ВПМС (JMS-T2000GC AccuTOF™ GC-Alpha, JEOL Ltd.). Мы использовали как режимы EI, так и режимы полевой ионизации (FI) с комбинированным источником ионов EI/FI/FD. Для каждого образца n=3 измерения выполняли с использованием EI, а n=1 измерения выполняли с использованием FI. Другие подробные условия показаны в Таблице 1.

Обработка данных

Данные ЭУ были преобразованы в общий формат ГХ-МС netCDF. Эти данные анализировали с использованием программы метаболомного анализа MS-DIAL (версия 4.9, RIKEN) для обнаружения пиков и идентификации соединений. Для идентификации соединений использовался msFineAnalysis AI (JEOL Ltd.), который может интегрировать и анализировать данные EI и FI, чтобы идентифицировать пики с более высокой точностью и предотвратить ошибочную идентификацию. После идентификации соединения мы нормализовали каждый пик по внутреннему стандарту и LOWESS, а интенсивность пика каждого образца экспортировали. Затем был проведен многомерный анализ в MetaboAnalyst 6.0. ⁴⁾. Для многомерного анализа анализ главных компонентов и иерархический кластерный анализ выполнялись после нормализации с помощью AutoScaling.

Таблица 1. Условия измерения ГХ-МС

Результаты и обсуждение

Результаты сравнения TICC

На рисунке 1 показаны данные TICC EI. В каждом образце было обнаружено множество соединений, специфичных для саке, включая сахарные спирты, такие как глицерин и глицерилглюкозид, сахара, такие как глюкоза, аминокислоты, органические кислоты. Поскольку пиковая интенсивность каждого компонента отличалась от образца к образцу, был проведен многомерный анализ.

*:Внешний м / г калибрант

Рисунок 1 TICC метаболитов в саке

Анализ главных компонентов

На рисунке 2 показаны результаты анализа главных компонентов (PCA), выполненного MetaboAnalyst на данных, нормализованных с помощью LOWESS и внутреннего стандарта. График оценок на рисунке 2-A показывает, что положительные и отрицательные оценки первого главного компонента (PC1) могут классифицировать Джунмай-шу и другие. Это может указывать на различия, связанные с добавлением или отсутствием дистиллированного спирта при производстве саке. Кроме того, можно было классифицировать Дайгиндзё-сю и другие на основе положительных и отрицательных оценок второго главного компонента (PC2). Предполагается, что это связано с разницей в скорости полировки риса. Обратите внимание, что на бутылке не была написана классификация Нигори-сю. Однако Нигори-сю был построен недалеко от Хондзо-сю и может иметь схожие характеристики.

Рисунок 2. Результаты анализа главных компонентов (A) График оценок, (B) График нагрузки

Результаты иерархического кластерного анализа (HCA)

Тепловая карта результата иерархического кластерного анализа (HCA) показана на рисунке 3. Тепловая карта показывает содержание каждого компонента по цвету (красный: высокий, синий: низкий), что позволяет визуализировать соединения, характерные для каждого компонента. образец. Например, результат сравнения пиковой интенсивности соединений пролина и валина, характерных для Джунмай-шу, показан на рисунке 4. Аминокислоты пролин и валин являются известным компонентом горечи сакэ5). Джунмай-шу готовится только из риса, коме-кодзи и воды и не содержит дистиллированного спирта. Поэтому обычно говорят, что его вкус позволяет вам почувствовать вкус и богатство риса. Возможно, именно валин и пролин связаны с неповторимым вкусом Джунмай-шу, измеренным на этот раз.

Рисунок 3. Результаты иерархического кластерного анализа (HCA).

Рисунок 4. Результаты сравнения пиковой интенсивности.
(А) Пролин, (Б) Валин

Результат анализа структуры AI неизвестного соединения

В данной работе обнаружено несколько соединений, не зарегистрированных в БД библиотеки. Например, мы объясним результат комплексного анализа и структурного анализа для пика RT 17.82 мин на рисунке 2. Масс-спектры этого соединения в Хондзозо-сю показаны на рисунке 5. Молекулярный ион м / г 947 был обнаружен только методом мягкой ионизации ФИ, а не ЭУ. Молекулярная формула была оценена как C₃₇H₈₉НЕТ₁₁Si₈ по результату оценки элементного состава молекулярного иона в ФВ. Предполагается, что эта молекулярная формула получена в результате дериватизации оксима и ТМС восстанавливающего дисахарида. Однако значение RI соединения с совпадающей молекулярной формулой и хитом № 1 в библиотеке DB (β-гентиобиоза, октакис(триметилсилил) эфир, метилоксим (изомер 1)) имело большую разницу в значении RI, составляющую Δ169 ( Таблица 2). Поэтому этот компонент считался незарегистрированным компонентом в БД библиотеки, хотя его молекулярная формула C₃₇H₈₉НЕТ₁₁Si₈. На рисунке 6 показаны результаты анализа структуры AI этого соединения. Первым кандидатом было производное дисахарида изомальтулозы. Поскольку производные изомальтулозы не зарегистрированы в библиотеке NIST, возможно, этим компонентом является изомальтулоза.
В этом отчете FI смог четко обнаружить молекулярные ионы даже для компонентов с большой массой, которые трудно проанализировать с помощью метаболомного анализа с использованием EI. Более того, оценить формулу структуры можно было даже тогда, когда она еще не была зарегистрирована в БД библиотеки.

Рисунок 5. Масс-спектры неизвестного соединения.

Таблица 2. Результат комплексного качественного анализа неизвестного соединения

Рисунок 6. Результат анализа структуры AI неизвестного соединения.

Выводы

В этом MSTips мы представили результаты нецелевого анализа метаболитов саке с использованием газовой хроматографии и времяпролетной масс-спектрометрии (GC-TOFMS). Даже высокополярные метаболиты, которые трудно измерить с помощью обычных измерений ГХ-МС, можно легко измерить с помощью дериватизации ТМС. Кроме того, многомерный анализ позволил классифицировать сакэ. Даже для ТМС-производных дисахаридов, которые трудно измерить с помощью GC-QMS из-за их больших молекулярных масс, мы смогли измерить молекулярные ионы с помощью GC-TOFMS и FI. Для соединений, не зарегистрированных в БД библиотеки, нам удалось оценить их структурную формулу с помощью программы анализа структуры неизвестного соединения msFineAnaанализ AI.
Из приведенных выше результатов было подтверждено, что GC-TOFMS и msFineAnasis AI эффективны в области метаболомики с использованием GC-MS.

Референции

1) Национальное налоговое агентство ЯПОНИИ. 2023. Обзор «Стандартов отображения качества методов производства саке».
https://www.nta.go.jp/taxes/sake/hyoji/seishu/gaiyo/02.htm (Написано на японском языке)
2) М. Убуката и др., Rapid Commun Mass Spectrom. 2020; 34: е8820.
3) А. Кубо и др., Масс-спектрометрии, 2023, 12, А0120.
4) МетабоАналитик 6.0. https://metaboanalyst.ca/
5) Харуо Огава. Ингредиенты и вкус японского сакэ. Журнал Японской ассоциации по защите от запахов, том 46, выпуск 5, 2015 г. (Написано на японском языке)

Решения по областям применения

Химия

Биология / Науки о жизни

Еда / Растения

Сопутствующие продукты

JMS-T2000GC AccuTOF™ GC-AlphaВысокоэффективный газовый хроматограф – времяпролетный масс-спектрометр

msFineAnalysis AIНеизвестные соединенияПрограммное обеспечение для анализа структуры

Категория продукта

Газовые хроматографы с масс-спектрометром (GC-MS)