Делаем MicroED, идеальный инструмент для определения кристаллической структуры, еще проще в использовании!

ИНТЕРВЬЮ 16

Нарухико Адачи
Доцент
Центр изучения динамики выживания в биологических науках.
Научно-исследовательский альянс Цукуба (TARA),
Университет Цукубы

В период с 2013 по 2015 год несколько исследователей предложили метод определения структуры кристаллов размером менее 1 мкм — слишком малых для анализа даже с помощью синхротронного рентгеновского излучения — с использованием данных электронной дифракции. Это метод MicroED (микроэлектронная дифракция) с применением криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ), прорывной технологии, позволяющей впервые наблюдать химические структуры в образцах, содержащих следовые количества полиморфных кристаллов. Доцент Нарухико Адачи из Центра изучения динамики выживания в рамках Цукубского альянса передовых исследований (TARA) продвигает совместное использование крио-ЭМ в качестве специализированного инструмента для MicroED, одновременно работая над созданием рабочих процессов электронной дифракции.

В лаборатории TARA создан специализированный прибор для микроэлектронной дифракции!

В 2018 году в Научно-исследовательскую организацию высокоэнергетических ускорителей (KEK), Межуниверситетскую научно-исследовательскую корпорацию, был введен криоэлектронный микроскоп (крио-ЭМ), специально назначенный на должность доцента (на тот момент) Нарухико Адачи, проводившего исследования в области регуляции экспрессии генов. Поскольку у него был опыт работы с крио-ЭМ в другом учреждении, ему было поручено управление этим прибором. Он предпринял усилия по расширению использования анализа отдельных частиц, подготовив руководства по рабочему процессу. С 2019 года он также начал работать над MicroED и пытался внедрить эксперимент MicroED в сотрудничестве с экспертом по рентгеноструктурному анализу кристаллов в KEK, Юсуке Ямадой, тогдашним доцентом. После этого, в 2023 году, доктор Адачи занял должность доцента в TARA, где были установлены два крио-ЭМ (CRYO ARM™ 300 II и CRYO ARM™ 200 производства JEOL Ltd.). С тех пор он внедрил эксперименты MicroED и неуклонно накапливал опыт в области измерений.

«Когда я пришла в TARA в 2023 году, доктора Ивасаки и Харада уже использовали CRYO ARM™ 300 II для анализа отдельных частиц. CRYO ARM™ 200, установленный одновременно, был предоставлен нам для использования в качестве специализированного микроэлектрохимического анализатора».

Плавное измерение микроЭД с помощью специализированного прибора.

Программа MicroED в TARA имеет две отличительные особенности:
Одна из особенностей заключается в том, что криоэлектронный микроскоп CRYO ARM 200 используется как специализированный прибор для микроэлектронной дифракции (MicroED). Хотя можно использовать один криоэлектронный микроскоп как для анализа отдельных частиц, так и для измерений MicroED, условия измерения необходимо перенастраивать каждый раз при переключении системы между этими двумя методами. Поскольку анализ отдельных частиц и MicroED требуют разных условий дозы электронов, переключение между ними занимает значительное количество времени. Однако в TARA криоэлектронный микроскоп CRYO ARM 200 с момента его установки используется как специализированный прибор для MicroED, что обеспечивает бесперебойную и эффективную работу. Криоэлектронный микроскоп, используемый исключительно для MicroED, является редкостью даже в глобальном масштабе. Его существование имеет огромную ценность и представляет собой одно из главных преимуществ TARA.
«С точки зрения эксплуатации оборудования, криоэлектронные микроскопы часто используются в первую очередь для анализа отдельных частиц, что остается доминирующим методом измерения. В результате существует очень мало криоэлектронных микроскопов, предназначенных исключительно для микроэлектронной дифракции. Поэтому возможность использовать CRYO ARM 200 в качестве специализированного прибора для микроэлектронной дифракции чрезвычайно ценна как с точки зрения удобства, так и с точки зрения стабильности работы».

Ключ к удобству использования — автоматизированный рабочий процесс.

Вторая отличительная особенность — это «простота использования».
Безусловно, существует спрос на метод микроэлектронной дифракции (MicroED), позволяющий получать чрезвычайно малые, следовые и полиморфные кристаллические структуры. Однако это не так просто, как анализ отдельных частиц, для которого уже хорошо отлажены рабочий процесс и программное обеспечение. Тем не менее, доцент Адачи из TARA ежегодно обрабатывает запросы на измерения методом MicroED примерно от 40 исследовательских групп. В чем заключается механизм этого процесса?

«Поскольку используемый нами криоэлектронно-микроскопический центр является общим, он должен быть прост в использовании для сторонних пользователей. Так как большинство сторонних пользователей обращаются к нему лишь раз в один-два месяца, его использование должно быть максимально удобным. Поэтому мы посчитали необходимым создать максимально автоматизированный рабочий процесс и подготовить подробное руководство. Однако возможности членов одного центра ограничены. Поэтому было создано онлайн-сообщество MicroED для сотрудничества нескольких центров. Мы внедрили программное обеспечение для автоматизации с помощью доктора Макино из Университета Осаки, доктора Янагисавы из Токийского университета и доктора Наканэ из Университета Осаки. Обработка измеренных данных была подготовлена ​​доктором Ямадой из Университета Тохоку при участии доктора Наканэ из Университета Осаки и других. После того, как аналитическая система для автоматизированного измерения и обработки данных была готова, мы многократно использовали её со специализированным прибором в TARA, повышая степень детализации, одновременно работая над подготовкой руководств».
Таким образом, мы смогли подготовить автоматизацию измерений и обработки данных, а также руководства пользователя, благодаря чему система MicroED в TARA стала простой в использовании даже для сторонних пользователей.

Достаточно ли прост курс MicroED в TARA даже для студентов старших курсов?

Согласно результатам исследований, даже студенты могут измерить около 200 частиц за ночь или 1000 частиц за выходные, если будут следовать максимально автоматизированному рабочему процессу MicroED, разработанному в TARA. В экспериментах, требующих определения кристаллов гуанина в рыбе, студенты старших курсов даже смогли измерить около 2000 частиц за неделю. В мире это редкий случай, когда студенты старших курсов в полной мере используют приборы MicroED вместе с криоэлектронным микроскопом. Это связано с тем, что рабочий процесс включает автоматизированные измерения и обработку данных, обеспечивая стабильную и надежную работу.

Результаты измерений кристаллов гуанина, а также результаты автоматизации рабочего процесса MicroED, представляются в виде оригинальной научной статьи.

«Известно, что рыбья чешуя блестит серебристым или синим цветом, потому что в рыбьей коже присутствуют кристаллы гуанина. Но был неизвестен, является ли гуанин α-типа или β-типа. Кристаллы гуанина в чешуе были слишком малы, чтобы определить их кристаллическую структуру с помощью рентгеновской дифракции. В 2024 году было обнаружено, что структура гуанина у лосося имеет β-тип. Это заставило нас задуматься, есть ли у других видов рыб также гуанин β-типа, или α-типа, или, возможно, полиморфные кристаллы, состоящие из β- и α-типов. Поэтому мы решили вместе со студентами старших курсов изучить клеточные структуры у основания чешуи тихоокеанской сайры, сабельной рыбы и сапфировой дамсфиши. MicroED может точно определить кристаллическую структуру, даже если образец содержит β- и α-типы, смешанные полиморфные кристаллы, поскольку он наблюдает отдельные кристаллы в образце. Однако в случае, если кристалл Кристалл, взятый из клетки, может быть поврежден или смешан с рыбьим мясом. Найти целевой кристалл практически невозможно, если не провести многочисленные измерения неопределенных частиц. В результате измерения приблизительно 2000 частиц нам удалось подтвердить существование кристаллов гуанина как β-типа, так и α-типа. Думаю, это стало возможным благодаря энтузиазму優秀ных студентов, а также передовой автоматизации измерений и обработки данных.
Кстати, я также попросил студентов достать рыбу для экспериментов. По мере того, как рыба теряет свежесть, кристаллы тоже разрушаются. Так что я уверен, что студенты, должно быть, выработали способность распознавать «свежую, живую тихоокеанскую сайру». (смеется)

MicroED восполняет пробелы в охвате других аналитических методов.

Метод MicroED позволяет получать дифракционные данные даже от кристаллов размером менее 1 мкм в образце, состоящем из следовых и полиморфных кристаллов. Однако измерение образца, содержащего смесь различных частиц, затруднено, если неясно, присутствует ли целевой кристалл. Используя только MicroED, сложно определить, сколько частиц необходимо наблюдать — 100 или 1,000. В таких случаях эффективно проверить наличие целевого кристалла в образце с помощью порошковой рентгеновской дифракции, а затем проанализировать структуру с помощью MicroED.
Более того, данные, полученные с помощью MicroED, позволяют определить структуру (форму) молекулы, но не идентифицировать типы элементов. MicroED сам по себе не может анализировать структуру совершенно неизвестных веществ. Если известны структурная формула и элементный состав, каждый атом может быть идентифицирован на их основе. Поэтому полезно сочетание с масс-спектрометрией и ЯМР. Таким образом, для использования MicroED в определении молекулярной структуры важно комбинировать его с другими аналитическими методами.

«Одна исследовательская группа долгое время пыталась определить структуры соединений, существующих только в виде крошечных кристаллов и в чрезвычайно малых количествах, используя порошковую рентгеновскую кристаллографию. Однако даже после двух лет им не удалось идентифицировать ни одну из структур. Несмотря на все это время, потраченное на улучшение качества кристаллов, одной лишь порошковой рентгеновской кристаллографии было недостаточно для определения структуры. В отчаянии они попробовали MicroED в TARA, и им удалось определить структуры 10 кристаллов всего за одну неделю! Вся исследовательская группа праздновала это как праздник (смеется). У нас было несколько подобных случаев. Измеряя улучшенные образцы кристаллов с помощью MicroED, структуры были определены сразу. Это отличный пример того, чего можно достичь, комбинируя порошковую рентгеновскую кристаллографию и MicroED. Даже если кристалличность сначала низкая, пока порошковая рентгеновская кристаллография указывает на присутствие целевого кристалла, качество кристалла можно постепенно улучшать. Затем каждый отдельный микрокристалл можно анализировать по отдельности с помощью MicroED. Я думаю, что такой рабочий процесс чрезвычайно хорошо подходит для…» МикроЭД."

Несмотря на новаторские возможности, метод MicroED имеет и ограничения при анализе совершенно неизвестных веществ. В этом смысле данная технология заполняет пробелы в охвате существующих методов анализа трехмерной структуры. Для максимального использования ее возможностей весьма эффективно сочетание с порошковой рентгеновской дифракцией, масс-спектрометрией и ЯМР.

Ключ к успеху MicroED — это предварительные встречи и участие в процессе оценки.

При использовании MicroED в TARA предварительное совещание имеет первостепенное значение для успешного проведения измерений. В идеале измерения должны проводиться на основе четкого общего понимания таких факторов, как состояние и характеристики образца, квалификация аналитика данных, цель анализа, знания заказчика в области кристаллографического анализа и технические ограничения MicroED.
«Если мы начинаем измерение после тщательного обмена информацией с заказчиком, то часто процесс проходит более гладко. Конечно, после изучения того, что хочет узнать заказчик, мы иногда отклоняем запрос на измерение, поскольку это невозможно с помощью MicroED. Кроме того, крайне важно, чтобы во время измерения присутствовал человек, хорошо знакомый с конкретным образцом. Если предоставлен только образец, это создает проблемы. Мы мало что знаем об образце. Если во время измерения что-то случится, нам понадобится человек, хорошо знающий образец, чтобы принимать решения по различным вопросам и обеспечить успешное проведение измерения».

Мы хотим создать национальный центр микрообразования!

С 2023 года доцент Адачи работает над темой «Стандартизация микроэкономики посредством автоматизации» в сотрудничестве со многими исследователями. Мы попросили его, эксперта по микроэкономике, знающего ее преимущества и недостатки, рассказать о своих будущих планах.
«Микроэлектронная микроскопия — это всё ещё новая технология, и во многих областях мы ещё осваиваемся. Помимо обеспечения бесперебойной работы криоэлектронной микроскопии в TARA как совместно используемого оборудования, мы хотели бы продолжить совершенствование операционной системы, внимательно прислушиваясь к отзывам пользователей в режиме реального времени и используя преимущества наличия специализированного прибора. Затем, как мы уже экспортировали систему TARA в другие исследовательские учреждения, такие как Университет Осаки и SPring-8, мы надеемся активно расширить её использование за пределами университета. В конечном итоге мы хотели бы создать «Национальный центр микроэлектронной микроскопии» с примерно 10 криоэлектронными микроскопами того же уровня, что и TARA, чтобы в будущем оказывать поддержку ещё большему числу исследователей!»

информация о продукте