Сверхбыстрый анализ трехмерных структур белков.
— Подготовка образца для криоэлектронной микроскопии за 10 минут —

ИНТЕРВЬЮ 15

Цуёси Иноуэ
Лаборатория структурного и функционального анализа биомолекул
Высшая школа фармацевтических наук, Университет Осаки

Трехмерная структура биомолекулы, например белка, становится важнейшей информацией для исследований и разработок в области биохимии и поиска лекарств. Хотя метод анализа с использованием криоэлектронной микроскопии широко распространен, профессор Иноуэ разработал инструмент, значительно повышающий скорость анализа, — «EG-grid™». Мы взяли интервью у профессора Иноуэ о его характеристиках.

Быстрое проникновение крио-ЭМ

Криоэлектронная микроскопия (крио-ЭМ) как метод трехмерного структурного анализа белков быстро получила широкое распространение. В международной общедоступной базе данных PDB (Protein Data Bank) ежедневно регистрируются новые данные о трехмерной структуре биомолекул (белков, нуклеиновых кислот и т. д.), которые были расшифрованы. Данные публикуются после выхода соответствующей научной статьи. Среди опубликованных структурных данных, данные, полученные с помощью электронных микроскопов, достигли 5,791 за 2024 год. Это составляет 37% от общего числа опубликованных данных за этот год.

Согласно графику, объем данных, полученных с помощью электронного микроскопа, начал расти примерно с 2017 года.
В этом году три исследователя, разработавшие фундаментальную технологию криоэлектронного микроскопа, были удостоены Нобелевской премии по химии. «Благодаря Нобелевской премии возросла осведомленность о криоэлектронной микроскопии и ее методе, что ускорило ее применение», — говорит профессор Цуёси Иноуэ (Высшая школа фармацевтических наук, Университет Осаки).
Популярность криоэлектронной микроскопии объясняется тем, что в ней не требуется кристаллизация белка, которая раньше была неизбежным процессом при рентгеноструктурном анализе. Рентгеноструктурный анализ является основным методом определения трехмерной структуры. Однако при этом методе белок необходимо превратить в крупный кристалл размером около 100 мкм. Подготовка образца занимает несколько месяцев и более. Кроме того, существуют белки и комплексы, которые трудно кристаллизовать. Криоэлектронная микроскопия позволяет анализировать труднокристаллизуемые белки, что является ее преимуществом.
Более того, анализ возможен даже при наличии небольшого количества образца, что является еще одним большим преимуществом. Сложный структурный анализ становится легким даже для белков, очистка которых затруднена, и для нестабильных комплексов, склонных к агрегации.

Подготовка образцов занимает месяц, даже для криоэлектронной микроскопии.

Итак, требуется ли для криоэлектронной микроскопии какая-либо обработка? Да, требуется. На начальном этапе подготовка образца и получение электронных микроснимков занимали некоторое время.

Для анализа трехмерной структуры используется метод анализа отдельных частиц. В этом методе с помощью криоэлектронной микроскопии получают множество изображений дискретной отдельной частицы. Для повышения точности необходимо подготовить множество изображений, полученных под разными углами, и с помощью компьютера реконструировать их в трехмерную структуру. Для этого необходимо подготовить подходящий образец, обеспечивающий эффективное получение изображений, что повышает общую скорость исследования.

Для подготовки образца традиционно использовался метод внедрения в лед. Это метод быстрого замораживания раствора для внедрения белков в аморфный лед. Однако этот метод сопряжен с трудностями в регулировании концентрации. При слишком высокой концентрации частицы перекрываются, и получить пригодные для исследования изображения невозможно. С другой стороны, при слишком низкой концентрации количество частиц уменьшается, и эффективность визуализации снижается. Кроме того, если лед толстый и частицы белка распределены по толщине, количество частиц, которые можно сфокусировать, ограничено, что еще больше снижает эффективность визуализации.

«Регулировка концентрации — непростая задача. Однако наиболее критичная проблема в методе внедрения белков во лед — это предпочтительная ориентация, при которой белки выстраиваются в одном направлении!» (Профессор Иноуэ)

Предпочтительная ориентация формируется в процессе замораживания. Однако в некоторых случаях ориентация в одном и том же направлении происходит еще до замораживания. Это происходит, когда высокогидрофобные белки прилипают к границе раздела фаз газ-жидкость, что приводит к ориентации в одном и том же направлении. При использовании традиционного метода подготовки образцов учет этих условий может занять месяц.

Профессор Иноуэ и его коллеги разработали инструмент для подготовки образцов — «EG-grid™ (эпоксидированная графеновая сетка)», отличное решение этих проблем. EG-grid™ представляет собой опорную основу из графена, содержащего эпоксидные группы. Поскольку эпоксидная группа обладает свойством захватывать остатки лизина, находящиеся на поверхности белковой частицы, белковые частицы прикрепляются под разными углами. Плотность эпоксидных групп предварительно задана, поэтому нет необходимости беспокоиться о регулировании концентрации раствора. Отсутствие распределения по толщине позволяет обеспечить правильную фокусировку при визуализации.

Использование сетки EG-grid™ позволило сократить время подготовки образцов, которое ранее занимало почти месяц, до 10-15 минут. Даже с учетом процесса замораживания, образец можно поместить в криоэлектронный микроскоп за 20 минут.

Повысилась и эффективность получения изображений. По сравнению с методом с использованием льда, количество пригодных для анализа частиц, полученных за одну фотосъемку, увеличилось, что позволило сократить общее количество необходимых изображений. Для некоторых белков анализ можно завершить, используя всего одну десятую или одну двадцатую часть от обычного количества изображений.

Развитие событий было спровоцировано "загадочным дезинфицирующим/дезодорантом".

Разработка EG-grid™ началась со знакомства с «загадочным дезинфицирующим/дезодорирующим средством».

В 2015 году в Университет Осаки поступил запрос. «Когда пациент с терминальной стадией рака полости рта использовал это дезинфицирующее/дезодорирующее средство для борьбы с запахом, рак, по-видимому, регрессировал. Не могли бы вы исследовать лежащий в основе этого механизм? Если эффект реален, мы хотели бы превратить это средство в противораковый препарат». Вместе с этим запросом была передана бутылка «загадочной воды».
Мы спросили: «Каков состав?» Ответ был лишь: «Мы не можем это раскрыть».
Это звучало довольно сомнительно. Однако, когда анализ был поручен профессору Шуничи Фукудзуми из Высшей инженерной школы (на тот момент), специалисту по радикалам, он быстро определил основной компонент и лежащий в его основе механизм.

Основным компонентом был хлорит-ион (ClO).₂-). Оказалось, что этот ион (ClO₂-) производит реактивный диоксид хлора (ClO₂).₂) в воде в необходимом количестве только при наличии целевых бактерий и вирусов — таков был механизм.

Позже Университет Осаки решил назвать эту высокобезопасную «воду» MA-T: Matching Transformation System (Система согласованного преобразования). Это сделано для того, чтобы избежать путаницы с другими веществами, способными генерировать газ на основе хлора.

Специально назначенный профессор Окубо (на тот момент), проводивший анализ в той же исследовательской группе, что и профессор Фукудзуми, был экспертом в фотохимии. Он заинтересовался: «Что произойдет, если мы облучим это светом?» В кислой среде он выделил диоксид хлора в виде газа и подверг его воздействию света. Он заметил, что тот расщепляется на активные формы кислорода и хлорный радикал. Далее он обнаружил, что использование этих активных форм кислорода и хлорного радикала позволяет окислять различные вещества.

Например, при окислении метана образуются метанол и муравьиная кислота. При этом не выделяется углекислый газ. Это был первый в мире случай синтеза метанола в условиях нормальной температуры и нормального давления. Метан можно получить путем ферментации коровьего навоза или на месте сбора нефти и природного газа, но его транспортировка затруднена. Однако, благодаря превращению его в жидкий метанол и муравьиную кислоту, транспортировка становится проще, и расширяется сфера его применения.

EG-grid™ — результат применения такой реакции окисления в криоэлектронной микроскопии. Если поверхность графена окисляется до образования гидроксильных групп (-OH), то на ней может быть замещена функциональная группа, способная иммобилизовать белок. Именно эта идея легла в основу разработки EG-grid™.
Таким образом, профессор Иноуэ посчитал, что недавно открытая реакция окисления и высокобезопасный MA-T могут быть применены в широком спектре областей, и подал заявку на участие в программе OPERA (Программа открытой инновационной платформы для предприятий, научно-исследовательских институтов и академических кругов, реализуемая Японским агентством науки и технологий) для дальнейших исследований в области практического применения. Однако для принятия заявки требовалось значительное финансирование совместных исследований. До крайнего срока оставалось менее трех месяцев. Одной из компаний, откликнувшихся на его срочный призыв, стала JEOL Ltd.

В 2018 году компания JEOL создала исследовательский альянс «Лаборатории Осакского университета и JEOL YOKOGUSHI», и, соответственно, финансирование исследований осуществлялось за счет средств этих лабораторий. Предложение профессора Иноуэ было успешно принято для программы OPERA (на период с октября 2019 года по март 2024 года).
Это позволяет разрабатывать EG-grid™ и получать поддержку проекта от компании JEOL. Крио-манипулятор CRYO ARM™ 200 который был установлен в лабораториях одновременно.

Проект OPERA принес множество результатов и получил высокую оценку. В феврале 2024 года он был удостоен премии премьер-министра.^th Премия Японии за открытые инновации. Исследование по окислению метана получило похвалу за достижения в области науки и техники от министра образования, культуры, спорта, науки и техники в апреле 2024 года. Кроме того, их усилия были отмечены в предложении Научного совета Японии «Объединение усилий промышленности, правительства, академических кругов и общественности для решения климатического кризиса» (опубликованном в октябре 2025 года).

Получено множество патентов. В ответ на просьбы нескольких компаний об использовании патентов была создана Японская промышленная ассоциация MA-T (ноябрь 2020 г.). Число компаний-членов достигает 91, а число компаний/организаций, оказывающих поддержку, составляет 22 (по состоянию на январь 2025 г.). На выставке EXPO 2025 в Осаке, провинция Кансай, компания MA-T установила стенд в «Павильоне здравоохранения Осаки» и представила средства по уходу за полостью рта для людей и животных, а также средства для ухода за окружающей средой с пространственным распределением/распылением. Оба мероприятия продемонстрировали потенциал MA-T в области высокой безопасности.

Расширение охвата криоэлектронной микроскопии

В настоящее время рассматриваются родственные продукты EG-grid™, которые содержат другие функциональные группы вместо эпоксидной. При присоединении хлорангидрида кислоты (хлорсодержащего соединения) он связывается с белком (аминогруппой и тиольной группой) быстрее, чем эпоксидная группа. Однако работать с ним сложно: его продажа по всему миру невозможна. «Возможно ли иммобилизовать белок с His-меткой?» — в ответ на этот вопрос уже разработано несколько прототипов. Однако все белки ориентированы в одном направлении, что является недостатком. «Тем не менее, поскольку мы можем получать изображения под углами, отличными от предпочтительной ориентации, это может служить временным решением» (профессор Иноуэ).

Если рассматривать слабое место комбинации криоэлектронной микроскопии и анализа отдельных частиц, то оно заключается в ее непригодности для анализа малых белков. Раньше считалось, что для этого необходимы белки массой 100 000 Да (*) или больше. Однако сейчас возможен анализ белков массой от 50 000 до 60 000 Да. Возможности 3D-структурного анализа с помощью криоэлектронной микроскопии постоянно расширяются.

*Да (Дальтон): Единица массы, определяемая как одна двенадцатая массы атома углерода-12.

«Когда рентгеноструктурный анализ был единственным вариантом, мы часто беспокоились о том, сможет ли этот белок образовать кристалл, и если да, то когда это может произойти?» (профессор Иноуэ). Теперь криоэлектронная микроскопия стала предпочтительным методом, позволяющим проводить немедленный анализ белков определенной массы.

В настоящее время спрос на EG-grid™ резко возрос.