Криоэлектронная микроскопия раскрывает тайны жизни, исследуя различные молекулярные структуры в условиях «глубокой заморозки».
ИНТЕРВЬЮ 07
Кэйити Намба
Профессор Высшей школы передовых биологических наук Университета Осаки.
Белки составляют все живые организмы и отвечают за множество функций, таких как иммунитет, обмен веществ, функции головного мозга и подвижность. Профессор Кейичи Намба, возглавляющий группу протонных наномашин Высшей школы передовых биологических наук Университета Осаки, интересуется замечательными механизмами, лежащими в основе этих функций, и активно стремится раскрыть их секреты, изучая трехмерные (3D) структуры биологических молекул. .
Понимание функций из структур
Человеческое тело состоит примерно из 100,000 XNUMX видов различных белков. Каждый из них играет уникальную роль, такую как формирование тканей тела, катализ метаболизма, обмен питательными веществами через клеточную мембрану или разрушение чужеродных веществ. Эти функции составляют часть жизнедеятельности нашего организма.
«Белки — это своего рода наномашины, функционирующие в живом организме. Меня очень интересует, какую роль играют такие наномашины и как они действуют», — говорит профессор Намба. Более 40 лет проф. Намба занимается исследованиями по выявлению функций белков по их структурам.
Белок представляет собой линейный полимер из сотен или тысяч аминокислот. Существует всего 20 различных аминокислот, из которых состоят белки, за исключением некоторых особых аминокислот. Таким образом, различные комбинации этих аминокислот в разных последовательностях образуют 100,000 3 различных видов белков. Фраза «линейный полимер» может вызвать в воображении образ гибкой цепи. Однако структура полностью отличается от цепи тем, что каждый белок имеет четкую трехмерную структуру. На самом деле длинная цепь аминокислот свернута в сложные структуры, и эти структуры идентичны среди белков одного вида; конструкция складывается точно в одной и той же точке и под одним и тем же углом. Однако иногда такие складки могут различаться, и, что интересно, одни и те же молекулярные структуры, но с разной трехмерной структурой, могут проявлять совершенно разные свойства и выполнять разные функции. Например, говорят, что источником беды с ГЭКРС, вызвавшей панику в пищевой промышленности в начале 3-х годов, был белок под названием прион, а не вирус и не химический агент. Удивительно, но прионы присутствуют в головном мозге человека и крупного рогатого скота. Эти прионы отличались от аномальных, вызывающих ГЭКРС, только некоторой частью своей трехмерной структуры. Таким образом, для определения функций белков необходимо не только понимать их молекулярные структуры с помощью аналитического оборудования и методов, но и детально наблюдать их трехмерные структуры.
Сложные биологические молекулярные двигатели
Профессор Намба является одним из пионеров исследований трехмерных структур биологических молекул. Его особенно интересует группа белков, называемых молекулярными моторами. Их называют двигателями, потому что они демонстрируют вращательные или линейные движения, подобные искусственным двигателям. Например, мышцы человека образованы миофибриллами, которые в основном состоят из белков актина и миозина, собранных в филаментные формы, и линейные движения этих белковых филаментов вызывают сокращение мышцы. Жгутиковый двигатель бактерий, более похожий на искусственный роторный двигатель, вращает длинную, похожую на хвост спиральную нить, называемую жгутиком, в качестве пропеллера, приводя в действие подвижность бактериальных клеток в вязких средах. Escherichia coli и Salmonella имеют несколько жгутиков, которые в комплекте для создания тяги, очень похожей на винт. Однако долгое время структуры молекулярных моторов было трудно визуализировать.
Профессор Намба был одержим этой загадкой и начал серию исследований, чтобы выявить трехмерные структуры этих молекулярных двигателей. Жгутиковый двигатель состоит примерно из 3 различных белков, которые образуют субструктуры, такие как ротор, статор и втулка, и его структура очень напоминает структуру обычных электродвигателей. Мышечные волокна состоят из встречно-пальцевых пучков актиновых и миозиновых филаментов, образующих чрезвычайно ценную шестиугольную решетку. Промышленные двигатели считаются одним из величайших изобретений человека, но приведенные выше данные свидетельствуют о том, что это мнение может быть высокомерным предположением.
Координированные движения этих молекулярных моторов требуют энергии. Хотя было известно, что ионы водорода проходят через статорные каналы жгутикового мотора за счет градиента электрохимического потенциала через клеточную мембрану и что гидролиз АТФ актомиозином является источником энергии для мышечного сокращения, их высокая энергетическая эффективность была загадочной. Утверждалось, что может быть задействована энергия теплового броуновского движения, но механизмы ее использования были неизвестны. Источники тепла обеспечивают энергию для атомных и молекулярных флуктуаций, но когда объект рассматривается на атомном уровне, атомы и молекулы движутся в произвольных направлениях с произвольными скоростями.
Считалось, что даже молекулярные двигатели не могут создавать тягу в определенном направлении за счет случайных движений молекул и атомов, вызванных теплом. Однако на самом деле они движутся в одном направлении. Следовательно, существует механизм, исправляющий случайные движения.
Недавно профессор Намба подошел гораздо ближе к ответу. Он обнаружил, что актомиозин в мышечных волокнах устроен как храповик, который позволяет предпочтительное движение в одном направлении, но не в другом. Такая сложная система построена из белковых молекул с отчетливо асимметричной и динамичной трехмерной структурой.
Криомикроскопия как граница
Криоэлектронный микроскоп JEOL "CRYO ARM™" в лаборатории профессора Намбы
Вышеупомянутые результаты стали возможными благодаря детальной визуализации трехмерных структур белков и их комплексов. Структурный анализ с помощью рентгеновской кристаллографии был основным методом определения структуры белков. В этом методе образец кристаллизованного белка облучают рентгеновским лучом и измеряют интенсивность дифрагированных лучей. Рентгеновская кристаллография белков существует с 3-х годов, и с помощью этого метода было решено 1950% известных белковых структур.
Однако этот метод имеет большой недостаток: кристаллизация является необходимым условием для анализа, но это непросто. Кроме того, кристаллизация имеет тенденцию фиксировать белковые структуры в наиболее стабильном виде. Хотя молекулярные моторы существенно изменяют свою структуру при выполнении своих функций, они могут кристаллизоваться только в стабильных состояниях. Другими словами, невозможно наблюдать изменяющиеся трехмерные структуры.
Криоэлектронная микроскопия привлекает внимание как способ преодоления этого недостатка. Криоэлектронные микроскопы оснащены столиком для образца, называемым «криостолом», который позволяет поддерживать температуру сетки образца при сверхнизких температурах, например, в диапазоне от -160°C до -270°C. Молекулы белка в тонкой пленке раствора на дырчатой углеродной сетке мгновенно замораживаются с помощью жидкого этана для сохранения конформации «живого» состояния. Запись проекционных изображений с разных направлений с помощью криоэлектронного микроскопа позволяет получить трехмерную структуру этих белков в момент их функционирования. Кроме того, необходимо заморозить лишь небольшое количество раствора образца, и нет необходимости исследовать ряд условий кристаллизации.
Профессор Намба сосредоточился на криоэлектронной микроскопии и более 20 лет способствовал развитию методов анализа с помощью криоэлектронных микроскопов. Идентификация механизма действия актомиозина в мышечных волокнах — одно из достижений, которое стало возможным благодаря криоэлектронной микроскопии. Выявление деталей трехмерных структур жгутиковых моторов, о чем давно мечтал профессор Намба, больше не мечта.
«Почему действия таких крошечных веществ, как белки, приводят к видимому движению мышц? Это вопрос, который привел меня в эту область исследований в школьные годы. Теперь я чувствую, что смог ответить примерно на половину вопросов, которые я были те времена», — сказал профессор Намба.
Микроскоп, который является лучшим в мире
Профессор Като (слева) и профессор Намба управляют аппаратом CRYO ARM™ из отдельной комнаты.
Криоэлектронная микроскопия давно отстает от рентгеноструктурного анализа из-за недостаточной разрешающей способности первой. Электронные микроскопы облучают образцы интенсивным электронным пучком, электроны рассеиваются в образце, а линзы создают изображение образца в соответствии с рассеянием электронов. Однако, поскольку электронные лучи легко повреждают биологические молекулы, интенсивность пучка необходимо сильно ослабить с помощью низкодозовых методов, чтобы избежать радиационных повреждений. Мы можем видеть только туманное, шумное изображение, как если бы в темной комнате была только крошечная лампочка.
Однако многолетние усилия по развитию технологий помогли нам решить эту проблему. Что касается аппаратного обеспечения, камеры претерпели существенные улучшения. Обычные ПЗС-камеры преобразуют рассеянные электроны в свет перед созданием изображения, и в этом процессе генерируются и усиливаются различные типы шума. Таким образом, эффективность обнаружения не может быть улучшена. Однако появление CMOS-камер, способных напрямую регистрировать электроны для записи изображений, улучшило как чувствительность, так и разрешение и даже позволило скорректировать движение образца с помощью изображений с высокой частотой кадров. Таким образом, с помощью этих камер можно получить значительно улучшенное качество изображения.
Программное обеспечение для обработки изображений также претерпело заметные изменения. С помощью современного программного обеспечения можно легко получить сотни тысяч проекционных изображений белковых молекул во всех различных ориентациях с помощью криомикроскопа. Эти проекции разбиты на группы, каждая из которых содержит проекции одинаковой ориентации. Теперь изображения одного класса можно накладывать друг на друга для улучшения отношения сигнал/шум, что позволяет наблюдать детали с высоким разрешением. На последнем этапе многие средние значения класса объединяются в трехмерную структуру. Такая сложная обработка данных стала возможной на лабораторном уровне благодаря передовым вычислительным возможностям современных компьютеров.
CRYO ARM™, представленный в лаборатории профессора Намбы, разработан в соответствии с его требованиями к «лучшему в мире микроскопу». Цель разработки состояла в том, чтобы сделать возможным структурный анализ с разрешением выше 2.0 Å (1 Å или ангстрем эквивалентен 0.1 нм), что лучше, чем стандартная рентгеновская кристаллография. Кроме того, в CRYOARM™ можно загрузить несколько сеток для образцов и автоматически заменить их на предметный столик в любое время для удобства пользователей. Существенное сокращение времени, необходимого для сбора и анализа данных изображения, является одним из самых больших преимуществ этого микроскопа. Трехмерный структурный анализ, который раньше занимал один год 3 или 5 лет назад, теперь можно выполнить за неделю.
Прорыв не за горами
Профессор Намба считает, что трехмерная структура не только белков, но и любых других биомолекулярных комплексов, включая липиды и нуклеиновые кислоты, будет визуализирована через 3 лет.
Особенно важным приложением является анализ мембранных белков на поверхности клеток. Эти белки являются мишенью действия фармацевтических реагентов, а их трехмерный структурный анализ поможет выявить механизмы, лежащие в основе их молекулярной функции, значительно улучшить результаты терапии и сделать возможным разработку лекарств без побочных эффектов.
В будущем может даже произойти движение к промышленному применению биологических молекулярных двигателей, таких как суперэнергосберегающие машины, которые требуют минимального источника энергии и работают с использованием тепла окружающей среды в качестве основного источника энергии. Это парадоксальное представление может бросить вызов давнему мнению о машинах и технике.
Хотя мы все еще далеки от реализации таких изобретений, их реализация может оказаться не за горами.
β-галактозидаза, разрешение 2.6 Å CRYO ARM™
Пример:
β-галактозидаза с PETGМикроскоп:
CRYO ARM™ (Шоттки 200 кВ) / Вершина К2Количество изображений:
2,500 за 3 дня от JADASРазмер изображения в пикселях:
0.8 Å/пиксельКоличество изображений частиц:
350,000 88,564 (начальный пикап), 3 XNUMX (для окончательной XNUMXD-реконструкции)Программного обеспечения:
Motioncor2, Gctf, Gautomatch, Relion2.0Общая доза:
70 e-/Å2 (70 кадров (0.2 сек/кадры x 14 сек)
Данные: предоставлены доктором Т. Като и доктором К. Намба, Осакский университет, август 2017 г.
Кэйити Намба
Профессор Высшей школы передовых биологических наук Университета Осаки.
После завершения докторантуры Высшей школы инженерных наук Университета Осаки он был назначен научным сотрудником Японского общества содействия развитию науки, научным сотрудником двух университетов США и руководителем группы Исследовательской корпорации развития Япония (нынешнее Японское агентство науки и технологий). Затем он занял должность директора по исследованиям в Международном институте перспективных исследований компании Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. в 1992 г. Он занимает эту должность с 2002 г. Он специализируется в области биофизики, а также анализа структур и функций биомолекулярных комплексов, таких как молекулярные моторы.
Размещено: октябрь 2017 г.