Замораживая изменчивые молекулярные структуры: криоэлектронная микроскопия раскрывает тайны жизни
ИНТЕРВЬЮ 07
Кэйити Намба
Профессор Высшей школы передовых биологических наук Университета Осаки
Все живые организмы состоят из белков; белки отвечают за множество функций: иммунитета, обмена веществ, функций головного мозга и подвижности. Профессор Кейити Намба, лидер группы протонных наномашин из Высшей школы передовых биологических наук Университета Осаки, стремится раскрыть секреты удивительных механизмов, лежащих в основе этих функций, изучая трехмерные (3D) структуры биологических молекул.
От структуры — к функциям
В человеческом теле содержится около ста тысяч разных видов белков. Каждый вид играет определенную роль: белки формируют ткани организма, отвечают за метаболизм (ферменты), через клеточную мембрану производят обмен питательными веществами, атакуют поступающие извне вещества (антитела) и т. д. Можно сказать, эти функции составляют саму жизненную активность.
«Белки — это своего рода “наномашины”, функционирующие в наших организмах. Мне безмерно интересно, какую роль играют эти крохотные механизмы, как они действуют», — делится профессор Кэйити Намба. Более сорока лет он работает над исследованиями функций белков, анализируя их структуры.
Белок — это макромолекула, представляющая собой цепочку от сотен до тысяч аминокислот. В состав белков входит всего двадцать аминокислот — за вычетом нестандартных. Словосочетание “цепочка из тысяч аминокислот” вероятно, вызывает в воображении образ некой цепи. Действительно, и в случае белка, и в случае цепи речь идет о ряде звеньев, но, в отличие от цепей, каждый белок обладает характерной для него объемной, трехмерной структурой. Длинная цепь аминокислот складывается сложным образом, причем одинаковые белки изгибаются в одних и тех же местах и под одним и тем же углом. И все же, бывает, белки с идентичными молекулярными структурами сворачиваются по-разному. Интересный факт: белки, различающиеся только трехмерной структурой, могут демонстрировать разные свойства. К примеру, фактором ГЭКРС (Губчатой энцефалопатии крупного рогатого скота), в начале двухтысячных годов взбаламутившей пищевую промышленность, считается не вирус и не лекарство, а белок под названием прион. Поразительно, но прион изначально присутствует в человеческом и коровьем мозге. Аномальный вид приона, ставший фактором ГЭКРС, отличался от нормального только участком трехмерной структуры. То есть для того, чтобы понять, как работает тот или иной белок, нужно не только подвергнуть лабораторному анализу его молекулярную структуру, но и рассмотреть его трехмерную структуру.
Биомолекулярные двигатели с тончайшим устройством
Профессор Намба уже давно увлечен исследованиями 3D-структур биологических молекул. Особенно его интересует группа белков — т. н. “биологические моторы”. Свое название эти белки получили из-за того, что, подобно настоящим моторам, совершают вращательное движение либо перемещаются по прямой линии. Мускулы человека строятся из миофибрилл, состоящих из комбинации актина и миозина: линейные движения этих органелл вызывают мышечные сокращения. Сильнее всего на мотор похож “молекулярный двигатель”, обеспечивающий вращение жгутиков в форме хвоста у бактерий и нужный для управления подвижностью бактериальных клеток в вязких средах. Кишечная палочка и сальмонелла обладают несколькими жгутиками; при движении они соединяют эти жгутики и вращают ими, подобно пропеллеру, создавая таким образом тягу. Однако их структуры до сих пор не изучены.
Увлекшись загадкой, профессор проводил исследование за исследованием в попытке раскрыть трехмерные структуры. “Жгутиковый двигатель”, как и предполагает название, состоит из запчастей, “произведенных” белками тридцати видов, — ротора, статора, втулки; по строению он очень напоминает обычный электромотор. Мышечные волокна состоят из переплетенных филаментов актина и миозина, образующих чрезвычайно сложную шестиугольную решетку. Двигатель считается одним из самых потрясающих человеческих изобретений, но это предположение оказалось более чем высокомерным.
Жгутиковым двигателям требуется энергия — как и любым нормальным моторам. Хоть и известно, что жгутиковый двигатель получает энергию за счет потока ионов водорода, проходящего по каналом статора, которые пронизывают клеточную мембрану, а мышечные волокна сокращаются благодаря способности актомиозина расщеплять АТФ, одними этими фактами невозможно объяснить высокую энергетическую эффективность. Предполагалось, что здесь может быть замешано броуновское движение, вызванное тепловым движением, однако механизмы не ясны. В основе своей теплота — это энергия, связанная с движением атомов и молекул, и, если рассмотреть объект на атомарном уровне, можно будет увидеть атомы и молекулы, двигающиеся в произвольных направлениях и с произвольными скоростями.
В теории, из-за произвольного движения молекул и атомов, вызванного теплотой, даже молекулярный двигатель не может стимулировать перемещение в заданном направлении. Но ведь движение производится в одном направлении. То есть существует механизм, “выпрямляющий” произвольное движение.
Недавно профессор в значительной мере приблизился к разгадке сущности этого механизма. Он выяснил, что в актомиозине из мышечного волокна имеется некое подобие храпового механизма, обеспечивающее движение в одном направлении и затрудняющее движение в других. Эта хитрая система выстроилась за счет того, что белковые молекулы меняют третичные структуры.
Рубеж под названием “крио”
Криоэлектронный микроскоп JEOL "CRYO ARM™" в лаборатории профессора Намбы
Таких результатов удалось достичь благодаря детальной визуализации трехмерных белковых структур и их комплексов. Долгое время для определения структур белков использовался структурный анализ методом кристаллографии. В рамках этой методики образец кристаллизованного белка подвергают рентгеновскому излучению и измеряют интенсивности дифрагированных пучков. Рентгеновская кристаллография белков существует с 3-х годов; с ее помощью были раскрыты 1950% известных белковых структур.
Однако данный метод имеет серьезную слабость. А именно необходимость предварительной кристаллизации. Сама по себе кристаллизация — сложный процесс. Кристаллизация фиксирует белковые структуры в наиболее стабильном состоянии. Когда молекулярные двигатели выполняют свои функции, их структуры существенно изменяются, а кристаллизовать можно только в стабильном состоянии. Иными словами, изменчивые трехмерные структуры изучить не получится.
И потому внимание привлекает криоэлектронный микроскоп. Данный микроскоп оснащен столиком для образцов, т. н. “криостоликом” (“cryo stage”), на котором можно изучать образцы, замороженные до предельно низких температур от -160 до -270 градусов. Подготовка образцов производится следующим образом: каждая молекула белка подвергается мгновенной заморозке в жидком этане, и образец оказывается заперт в “живом” состоянии. На криоэлектронном микроскопе можно с разных сторон обозреть проекцию образца, что позволяет запечатлеть структуру молекулы белка на момент движения в виде трехмерной модели. Так как речь идет лишь о заморозке, не придется даже изучать условия кристаллизации.
Криоэлектронная микроскопия привлекла внимание профессора более двадцати лет назад — с тех пор он занимался развитием аналитических методик на криоэлектронном микроскопе. С помощью криоэлектронного микроскопа он раскрыл, как функционирует актомиозин в мышечных волокнах. На горизонте — детальное изучение трехмерной структуры жгутиковых двигателей, которое профессор лелеял в мечтах.
«Почему действия таких крохотных веществ, как белки, обращаются в видимое глазом движение мускулов? Это и есть причина, по которой я начал исследования. Кажется, примерно наполовину мне удалось выполнить домашнюю работу со студенческих пор».
Микроскоп, который является лучшим в мире
Профессор Като (слева) и профессор Намба управляют аппаратом CRYO ARM™ из отдельной комнаты.
Долгое время криоэлектронная микроскопия отставала от рентгеноструктурного анализа. Причиной тому было недостаточно высокое разрешение. Электронный микроскоп направляет на образец мощный электронный пучок, фиксирует поток электронов, прошедший сквозь образец, и формирует изображения на основе рассеяния электронов. Однако из-за того, что структура биомолекул из-за сильного облучения разрушается, приходилось снижать мощность пучка — видно не больше, чем в темной комнате, которую попытались осветить крохотной лампой.
Однако многолетние усилия по развитию технологий помогли нам решить эту проблему. Что касается аппаратного обеспечения, камеры претерпели существенные улучшения. Обычные ПЗС-камеры преобразуют рассеянные электроны в свет перед созданием изображения, и в этом процессе генерируются и усиливаются различные типы шума. Таким образом, эффективность обнаружения не может быть улучшена. Однако появление CMOS-камер, способных напрямую регистрировать электроны для записи изображений, улучшило как чувствительность, так и разрешение и даже позволило скорректировать движение образца с помощью изображений с высокой частотой кадров. Таким образом, с помощью этих камер можно получить значительно улучшенное качество изображения.
Программное обеспечение для обработки изображений также претерпело заметные изменения. С помощью современного программного обеспечения можно легко получить сотни тысяч проекционных изображений белковых молекул во всех различных ориентациях с помощью криомикроскопа. Эти проекции разбиты на группы, каждая из которых содержит проекции одинаковой ориентации. Теперь изображения одного класса можно накладывать друг на друга для улучшения отношения сигнал/шум, что позволяет наблюдать детали с высоким разрешением. На последнем этапе многие средние значения класса объединяются в трехмерную структуру. Такая сложная обработка данных стала возможной на лабораторном уровне благодаря передовым вычислительным возможностям современных компьютеров.
CRYO ARM™, представленный в лаборатории профессора Намбы, разработан в соответствии с его требованиями к «лучшему в мире микроскопу». Цель разработки состояла в том, чтобы сделать возможным структурный анализ с разрешением выше 2.0 Å (1 Å или ангстрем эквивалентен 0.1 нм), что лучше, чем стандартная рентгеновская кристаллография. Кроме того, в CRYOARM™ можно загрузить несколько сеток для образцов и автоматически заменить их на предметный столик в любое время для удобства пользователей. Существенное сокращение времени, необходимого для сбора и анализа данных изображения, является одним из самых больших преимуществ этого микроскопа. Трехмерный структурный анализ, который раньше занимал один год 3 или 5 лет назад, теперь можно выполнить за неделю.
Прорыв не за горами
Профессор Намба считает, что трехмерная структура не только белков, но и любых других биомолекулярных комплексов, включая липиды и нуклеиновые кислоты, будет визуализирована через 3 лет.
Особенно важным приложением является анализ мембранных белков на поверхности клеток. Эти белки являются мишенью действия фармацевтических реагентов, а их трехмерный структурный анализ поможет выявить механизмы, лежащие в основе их молекулярной функции, значительно улучшить результаты терапии и сделать возможным разработку лекарств без побочных эффектов.
В будущем может даже произойти движение к промышленному применению биологических молекулярных двигателей, таких как суперэнергосберегающие машины, которые требуют минимального источника энергии и работают с использованием тепла окружающей среды в качестве основного источника энергии. Это парадоксальное представление может бросить вызов давнему мнению о машинах и технике.
Хотя мы все еще далеки от реализации таких изобретений, их реализация может оказаться не за горами.
β-галактозидаза, разрешение 2.6 Å CRYO ARM™
Пример:
β-галактозидаза с PETGМикроскоп:
CRYO ARM™ (Шоттки 200 кВ) / Вершина К2Количество изображений:
2,500 за 3 дня от JADASРазмер изображения в пикселях:
0.8 Å/пиксельКоличество изображений частиц:
350,000 88,564 (начальный пикап), 3 XNUMX (для окончательной XNUMXD-реконструкции)Программного обеспечения:
Motioncor2, Gctf, Gautomatch, Relion2.0Общая доза:
70 e-/Å2 (70 кадров (0.2 сек/кадры x 14 сек)
Данные: предоставлены доктором Т. Като и доктором К. Намба, Осакский университет, август 2017 г.
Кэйити Намба
Профессор Высшей школы передовых биологических наук Университета Осаки
После завершения докторантуры Высшей школы инженерных наук Университета Осаки он был назначен научным сотрудником Японского общества содействия развитию науки, научным сотрудником двух университетов США и руководителем группы Исследовательской корпорации развития Япония (нынешнее Японское агентство науки и технологий). Затем он занял должность директора по исследованиям в Международном институте перспективных исследований компании Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. в 1992 г. Он занимает эту должность с 2002 г. Он специализируется в области биофизики, а также анализа структур и функций биомолекулярных комплексов, таких как молекулярные моторы.
Время публикации: октябрь 2017 г.