Анализ COSY/TOCSY│Интерпретация спиновых корреляций с использованием 2D ЯМР

В этой статье мы объясняем основные принципы и методы анализа COSY и TOCSY, которые являются типичными методами 2D ЯМР. Начиная с подтверждения корреляций между соседними протонами с помощью COSY, мы представляем анализ спиновых сетей с помощью TOCSY и анализ углеводов с использованием 1D и 2D TOCSY, приводя конкретные примеры.

Что такое COSY?

COSY (корреляционная спектроскопия) — это базовый метод визуализации связей между соседними молекулами. ¹Hs с использованием 2D ЯМР. Традиционно гомодекуплинг ¹Hs использовался для определения местоположения соседних объектов. ¹Атомы водорода анализировались по одному. Однако с появлением COSY стало возможным анализировать ¹H-¹Корреляции H-связей одновременно в широком диапазоне, что значительно повышает эффективность структурного анализа. В настоящее время COSY широко используется в качестве вводного метода 2D ЯМР для подтверждения ¹H-¹H-корреляции.

На рис. 1 показан COSY-спектр для области, соответствующей ¹Hs в положениях от 1 до 6 в "цис-3-гексениловом эфире коричной кислоты". Как указано выше, когда сигналы корреляции и ¹Спектры H одномерного изображения по обеим осям соединены, можно наблюдать 5 корреляций: 1-2, 2-3, 3-4, 4-5 и 5-6. Результат позволяет сделать вывод, что ¹Атомы водорода от 1 до 6 имеют по одному соседнему атому в структуре. Кроме того, метод COSY позволяет нам косвенно понять связь между атомами углерода на основе информации о взаимодействии соседних атомов. ¹Эта информация крайне важна для определения структуры основания.

Однако что происходит, когда спектр COSY настолько сложен, как на рис. 2?
Рассматривая область, выделенную зеленым цветом, можно заметить, что сигналы перекрываются, что затрудняет выявление корреляций. В этой ситуации дальнейшее определение структуры представляется практически невозможным.

Для таких соединений, как полисахариды или циклические молекулы, где ¹Сигналы протонов (H) плотно располагаются в узком диапазоне, как показано на рисунке 2, поэтому полагаться только на COSY может привести к тупику в структурном анализе.

Одним из решений в ситуации, когда метод COSY не обеспечивает адекватного анализа, является метод TOCSY.
В следующем разделе мы объясним, что такое TOCSY.

Что такое TOCSY?

TOCSY (Total Correlation SpectroscopY) — это двухмерная ЯМР-техника, позволяющая визуализировать все ¹Спектры Хартмана-Хана (TOCSY) позволяют одновременно выявлять атомы водорода, принадлежащие к одной и той же спиновой сети. Поскольку спиновые связи распространяются по всей сети, TOCSY выявляет не только соседние положения, но и корреляции по всей спиновой системе, что делает его весьма эффективным для анализа сложных органических молекул, сахаров и аминокислот. TOCSY также известен как HOHAHA (HOmonuclear HArtmann-HAhn spectroscopy), что по сути означает тот же эксперимент.

Например, предположим, что существуют атомные связи, как показано на рисунке 3. H_A·ЧАС_B·ЧАС_C·ЧАС_D связаны посредством спиновых взаимодействий между соседними атомами. ¹Hs, и эта связь называется спиновой системой (спиновой сетью). Спиновая система не распространяется через четвертичные атомы углерода без присоединенного H или ¹H связан через кислород, поэтому сеть прерывается в этих точках. TOCSY позволяет нам наблюдать корреляции между ядрами в одной и той же спиновой системе, даже если они не связаны напрямую — например, между ¹H_A и ¹H_DВ методе TOCSY намагниченность передается поэтапно: от H_A к Н_Bзатем из H_B к Н_Cи наконец, от H_C к Н_DДругими словами, намагниченность перемещается по спиновой системе, соединяя все элементы на своем пути. Этот перенос намагниченности называется «реле». TOCSY наблюдает корреляционные сигналы, основанные на этом релейе.

На рис. 4 показаны последовательности импульсов для COSY и TOCSY. В COSY используются два 90° импульса, тогда как в TOCSY второй импульс представляет собой импульс спиновой блокировки. Длительность этого импульса спиновой блокировки называется «временем смешивания», которое является ключевым параметром в TOCSY. Увеличивая время смешивания, можно наблюдать корреляционные сигналы, передаваемые на большие расстояния внутри спиновой системы.

Время смешивания и корреляционный сигнал TOCSY

На рис. 5 представлена ​​схематическая диаграмма спектра TOCSY соединения, имеющего две независимые спиновые сети. Каждая спиновая сеть обозначена желтым и зеленым цветами. Как показано, TOCSY наблюдает корреляцию всех ¹H-сигналы принадлежат каждой спиновой сети. В это время, если сигналы типа «A» и «a» в основном спектре по обеим осям появляются вдали от области, где сигналы появляются плотно, сигналы легко классифицируются отдельно в сетях желтого и зеленого цвета, что позволяет подтвердить принадлежность каждой спиновой сети.

Далее рассмотрим, как изменяется корреляционный сигнал А при изменении времени перемешивания.
На рисунке 6 представлен увеличенный фрагмент корреляции А из схематической диаграммы TOCSY на рисунке 5.
При коротком времени перемешивания намагниченность ¹H_A перемещается только в соседний ¹H_Bи корреляционный сигнал B с ¹H_B появляется.
При дальнейшем увеличении времени перемешивания намагниченность смещается в ¹H_Cи появляется корреляционный сигнал C. При дальнейшем увеличении времени перемешивания намагниченность смещается в ¹H_Dи появился корреляционный сигнал D. В результате становится ясно, что существует связь между ¹H_A - ¹H_B - ¹H_C - ¹H_D.

Чем дольше время перемешивания, тем дальше может перемещаться намагниченность. Следовательно, при достаточно длительном времени перемешивания намагниченность может передаваться по всей поверхности. ¹Hs в пределах одной спиновой системы, что позволяет обнаруживать корреляционные сигналы для всех ¹В этой спиновой системе присутствуют атомы водорода.
Кроме того, путем сравнения спектров, полученных при различном времени перемешивания, можно определить последовательность событий. ¹Также могут быть известны H-соединения.

Пример анализа сахарозы с использованием двумерной токсикосеквенциальной спектроскопии (2D TOCSY).

Здесь мы приводим пример анализа сахарозы с использованием двумерной TOCSY. Сахароза — это дисахарид, состоящий из глюкозы и фруктозы, связанных гликозидной связью. Сахароза содержит в общей сложности 22 ¹Hs, но поскольку образец растворен в тяжелой воде, ¹Атомы водорода гидроксильных групп (-OH) не наблюдаются из-за дейтериевого обмена. Поэтому в данном случае 14 ¹Наблюдаются H, за исключением 8. ¹Hs гидроксильной группы.

На рис. 7 представлен COSY-спектр сахарозы. Участок, выделенный красной рамкой, увеличен и показан на рис. 8.

На рисунке 7 относительно легко обнаружить шесть корреляционных сигналов.
Однако интерпретация корреляций сигналов, появляющихся в областях, где химические сдвиги близки друг к другу, например, обозначенных красными кругами на рисунке 8, представляет собой сложную задачу. Многие могут застрять на этом этапе анализа.
Поэтому мы попробуем использовать метод TOCSY.

Рис. 9. Спектры TOCSY, измеренные при временах смешивания 20 мс и 150 мс.

На рисунке 9 показаны спектры TOCSY, измеренные при временах смешивания 20 мс и 150 мс соответственно. Сначала мы сосредоточимся на корреляционном сигнале ¹Сигнал H в аномерном положении глюкозы, который появляется при химическом сдвиге, значительно отличающемся от других сигналов. Как показано ранее на рисунке 6, мы рассмотрим, как корреляционные сигналы изменяются с разным временем смешивания, чтобы подтвердить информацию, передаваемую из источника. ¹H в аномерном положении. Также можно заметить, что с увеличением времени смешивания появляется больше корреляционных сигналов. Кроме того, для областей, где сигналы перекрываются, проще сравнивать данные, полученные путем среза, а не двумерный спектр. Поэтому мы будем сравнивать каждый одномерный спектр, полученный путем извлечения срезов вдоль оси X (в области, обозначенной зеленой рамкой), для подтверждения корреляционного сигнала. ¹H.

На верхнем спектре на рисунке 10 показан обычный ¹Спектр протонов. Ниже представлены данные, полученные при изменении времени перемешивания от 20 мс до 200 мс. Сигнал слева соответствует Glu H-1, который мы рассматриваем как отправную точку релейной цепи. При времени перемешивания 20 мс появляется только корреляция с соседним Glu H-2, что указывает лишь на связь между позициями 1 и 2. По мере увеличения времени перемешивания сигналы корреляции появляются последовательно, и в конечном итоге можно подтвердить связи от позиции 1 до позиции 6 в глюкозном фрагменте. Хотя с помощью COSY было сложно четко идентифицировать корреляционного партнера Glu H-5, TOCSY предоставил эту информацию.

Далее рассмотрим реле, начиная с Fru H-3′.
Как и в случае с сахарозным фрагментом, на рисунке 11 показаны спектры TOCSY, полученные при различном времени перемешивания.

Рисунок 11. Спектры TOCSY, измеренные при временах смешивания 20 мс и 150 мс.

Как и прежде, мы сравниваем срезы данных вдоль оси X для сигнала, который появляется в области без значительного перекрытия — на этот раз фокусируясь на Fru H-3′.

На верхнем спектре на рисунке 12 показан обычный спектр ¹H, а ниже него — данные, полученные при различном времени перемешивания.
Как и прежде, в качестве отправной точки эстафеты мы берем Fru H-3′. По мере увеличения времени перемешивания появляются корреляции с Fru H-4′, Fru H-5′ и Fru H-6′, что позволяет нам подтвердить связи внутри фруктозного фрагмента.

Таким образом, метод TOCSY позволяет разделить спиновые сети внутри соединения, содержащего несколько спиновых сетей. Варьируя время перемешивания, также можно оценить расстояние от начальной точки. ¹H. Даже когда спектр COSY становится сложным, использование TOCSY оказывает существенную помощь в определении молекулярной структуры.

Пример анализа глюкозы с использованием одномерной токсикодинамики (1D TOCSY).

1D TOCSY — это одномерная версия 2D TOCSY, и основной принцип тот же.
В то время как двумерная TOCSY используется для анализа спиновой сети всей молекулы, одномерная TOCSY более эффективна, когда необходимо исследовать только ту спиновую систему, к которой относится конкретный параметр. ¹H принадлежит. 1D TOCSY наблюдает перенос намагниченности — то есть, ретрансляцию — от избирательно возбужденного ¹H. Постепенно увеличивая время перемешивания, можно отслеживать распространение намагниченности вдоль спиновой сети. Для селективного возбуждения лучше всего выбрать ¹H, химический сдвиг которого достаточно отделен от других сигналов.
Еще одно преимущество одномерного измерения заключается в том, что по сравнению с двухмерным измерением оно обеспечивает более высокое цифровое разрешение и упрощает предотвращение наложения сигналов.

Теперь давайте рассмотрим пример анализа уровня глюкозы.

Глюкоза существует в водном растворе в виде α- и β-аномеров. Следовательно, ¹Спектр ЯМР 1H представляет собой смешанный спектр α-глюкозы и β-глюкозы, как показано на рисунке 13. Для селективного возбуждения ¹Сигнал H, как правило, выбирают ¹H появляется в более слабом поле, чем другие (в случае сахаров, ¹H в аномерном положении). Результат одномерного эксперимента TOCSY, полученного путем селективного возбуждения аномерного фрагмента. ¹Атом водорода (H) в положении 1 α-глюкозы показан на рисунке 14.

Варьируя время перемешивания от 20 мс до 200 мс, удалось проследить спиновую сеть, начиная с аномерной части. ¹H в позиции 1 α-глюкозы используется в качестве точки переноса. Нижний спектр со временем смешивания 200 мс представляет собой выделение только спиновой сети α-глюкозы из смешанного спектра α-глюкозы и β-глюкозы. Кроме того, как объяснялось ранее, 1D TOCSY обеспечивает лучшее цифровое разрешение, чем 2D-срезы данных.
Таким образом, одномерный метод TOCSY более эффективен для извлечения и подтверждения спиновых систем, связанных спиновыми взаимодействиями, из спектров с высокой плотностью спинов.
Рекомендуется использовать одномерную и двухмерную TOCSY-микроскопию в зависимости от цели.

Родственное применение

Спектроскопическое разделение смешанных фторорганических соединений методом 2D. ¹⁹F-¹⁹F TOCSY --Для извлечения 1D ¹⁹Спектр ЯМР 19F каждого соединения --

Связаться с нами

Если вас интересует анализ спиновых сетей с использованием TOCSY или HSQC-TOCSY, или подробная информация об приборах ЯМР, пожалуйста, свяжитесь с компанией JEOL. Благодаря множеству примеров применения и технической поддержке мы окажем вам существенную помощь в анализе молекулярной структуры.

Каталог