Основы NOE/NOESY: причины и решения, если NOE не обнаруживается

NOE (ядерный эффект Оверхаузера) — важный метод измерения ЯМР, позволяющий выявлять соотношения пространственной близости внутри молекул. В этой статье мы обсуждаем разницу между разностным NOE, одномерным NOESY и двумерным NOESY, а также выбор каждого метода и время релаксации, являющееся ключевым для анализа. Также рассматриваются причины и решения в случаях, когда NOE не обнаруживается. Кроме того, мы отвечаем на часто задаваемые вопросы и объясняем ключевые моменты эффективного использования измерения NOE.

Что такое измерение NOE?

Измерение ядерного эффекта Оверхаузера (NOE) — это метод наблюдения ядер, находящихся в пространственно близких расстояниях. NOE используется для определения стереохимии молекул, различения изомеров и определения положения замещающей группы при исследовании низкомолекулярных соединений.

Принцип NOE

ЯЭО — это явление, при котором пространственно близкие ядра магнитно воздействуют друг на друга и вызывают изменение интенсивности сигнала ЯМР.

Рассматривая NOE, мы думаем о двух протонах в одной молекуле, как показано на рисунке выше.
Когда эти протоны находятся близко друг к другу, наблюдается ЯЭО из-за дипольного взаимодействия.
С другой стороны, если расстояние между протонами велико, то NOE не наблюдается, поскольку отсутствует дипольное взаимодействие.
Известно, что дипольное взаимодействие тесно связано с межъядерным расстоянием и молекулярной подвижностью, и если расстояние между двумя ядрами короче 6 Å, могут наблюдаться ЯЭО.
С другой стороны, поскольку величина взаимодействия пропорциональна межъядерному расстоянию (r) в минус шестой степени (r-⁶), когда межъядерное расстояние увеличивается, взаимодействие быстро уменьшается, что затрудняет наблюдение ЯЭО.

Как наблюдать NOE

В отличие от расщепления, вызванного спиновой связью, ЯЭО не наблюдается в спектре ЯМР (1D, 2D ЯМР), который мы представили до сих пор.
Таким образом, для измерения NOE необходимы следующие шаги.

• Воздействие радиоволн на конкретный протон (возбуждение/насыщение)

• Наблюдение за изменением интенсивности сигнала других протонов

• Оценить, исходят ли эти изменения от NOE.

Типы измерения NOE

Существует три основных типа измерений NOE.

• Разница NOE: наблюдайте стационарное состояние NOE, измеряя разницу в спектрах при наличии и отсутствии радиоволнового облучения.

• 2D NOESY: наблюдение переходного NOE с использованием 2D-спектра.

• 1D NOESY: выборочно возбуждать протоны и наблюдать кратковременный NOE в одном измерении.

Стационарное состояние NOE заключается в длительном облучении радиоволнами, насыщении определенного протона и наблюдении за изменением интенсивности сигнала других протонов после того, как состояние насыщения станет устойчивым.
Кратковременные ЯЭО наблюдаются во время смешивания после того, как состояние спина временно изменяется под действием короткого периода радиоволнового облучения.
Поскольку механизмы, посредством которых генерируются НЭ, различны, условия измерений для каждого метода должны определяться с учетом характеристик каждого метода.

Измерение разницы NOE

Измерение разности NOE — это метод проверки изменения интенсивности сигнала соседних протонов путем измерения разницы между спектрами конкретного протона при облучении радиоволнами и без облучения радиоволнами.

Как показано выше, два протона, H_I и Н_S будут рассмотрены. H_I и Н_S находятся на близком пространственном расстоянии и имеют дипольное взаимодействие.
(Б) есть ¹Спектр H, когда H_S не подвергался облучению.

Здесь, когда радиоволна излучается в H_S для насыщения H_S, сигнал H_S становится невидимым. В это время интенсивность сигнала H_I становится большим из-за дипольного взаимодействия между H_I и Н_S. Это «Изменение, вызванное ненаблюдаемой прибылью».
Поскольку изменение интенсивности сигнала за счет NOE очень мало, разница между (A) и (B) рассчитывается так, чтобы сделать ее более наглядной.
NOE, наблюдаемый по разностному NOE, называется «равновесным состоянием NOE».
В общем случае, для низкомолекулярных соединений с высокой скоростью молекулярного движения в растворе, когда изменение сигнала облучаемого протона направлено вниз, сигнал NOE наблюдается как восходящий. Это называется «положительным NOE».

Представлен реальный пример измерения разницы NOE с использованием этилкротоната.

Мы хотим определить, является ли конформация двойной связи цис- или транс-конформацией, используя измерение разностного ядерного эффекта ОЭ. Протон метильной группы, обозначенный как А, облучается, и наблюдается соответствующий ядерный эффект ОЭ.

В верхней части рисунка выше, ¹Показан спектр H этилкротоната.
В нижней части показан разностный спектр ЯЭО, когда протон метильной группы в атоме А насыщен.
Эти данные измерены с помощью прибора 400 МГц, а сигналы NOE наблюдаются вверху в точках B и C.

На основании полученных результатов можно сделать вывод, что облучение протона метильной группы в A привело к наблюдаемым NOE в B и C, что указывает на то, что этилкротонат имеет транс-конформацию.

1D НОЕСИ

1D NOESY — это метод выборочного возбуждения определенного протона и наблюдения переходного NOE между определенным протоном и другими пространственно близлежащими протонами в виде одномерного спектра.
В этом измерении мягкий импульс (узкополосный импульс) и импульсный градиент поля используются для возбуждения только интересующего протона, а также регистрируется изменение NOE за время смешивания.
Поскольку нет необходимости вычитать спектры, как в разностном NOE, получаются спектры, которые легко анализировать.
1D NOESY подходит, когда вас интересует конкретный протон или когда вы хотите проверить NOE простым способом.

Здесь представлен пример одномерного измерения NOESY с использованием этилкротоната. На рисунке (B) показан одномерный спектр NOESY, полученный при селективном возбуждении протона A, а (C) — спектр, полученный при селективном возбуждении протона C.
В отличие от разностных спектров NOE, 1D NOESY не показывает остаточные сигналы, вызванные вычитанием двух спектров, полученных до и после облучения радиоволнами, что упрощает анализ спектра.

Метод интерпретации аналогичен методу разностного NOE: мы проверяем, как выглядят другие сигналы, когда сигнал селективно возбужденного протона отображается сверху вниз.
В примере с этилкротонатом, когда протон А селективно возбуждается, положительные NOE наблюдаются в B и C. Наоборот, когда возбуждается протон С, положительный NOE наблюдается только в A. Эти результаты также подтверждают оценку того, что этилкротонат имеет стереохимию транс-типа.
Таким образом, при определении стереохимии с неоднозначными пространственными расположениями важно измерять 1D NOESY селективного возбуждения каждой части.

2D НОЕСИ

2D NOESY — это метод наблюдения взаимодействия (NOE) между пространственно близкими протонами в молекуле в виде двумерного спектра.
В этом эксперименте наблюдается проявление того, как изменяется NOE (транзиентный NOE) во время смешивания после временного изменения состояния спина протона.
Полученный спектр отражал собственные сигналы по диагонали и коррелированные сигналы между пространственно близкими протонами.
Поскольку 2D NOESY позволяет проводить комплексную корреляцию NOE во всей молекуле, он подходит для анализа сложных структур и подтверждения полного распределения сигналов.

Далее мы объясним, как интерпретировать двумерные спектры NOESY. Как показано на рисунке выше, когда A и C, B и D находятся в непосредственной близости друг от друга, возникают такие корреляционные сигналы.
Данные, разделенные на срезы в позициях A и B (синяя пунктирная линия) в направлении оси X, эквивалентны одномерным спектрам NOESY путем избирательного возбуждения A и B соответственно.

На этом рисунке показана 2D NOESY этилкротоната.
При рассмотрении каждого среза данных сигналы в селективно возбужденной части (красного цвета) направлены вниз, в то время как сигналы с корреляцией NOE (черного цвета) направлены вверх (положительный NOE).
При рассмотрении корреляционных сигналов, выделенных черным цветом, можно обнаружить следующие корреляции NOE.

А：Б и С
Б：А
С：А
Д：Е
Е：Д

Кроме того, если сосредоточиться на корреляциях NOE между A, B и C, то результаты подтверждают наличие конформации транс-типа, что согласуется с ранее упомянутыми результатами различий NOE и 1D NOESY.

Простое руководство по выбору метода измерения NOE

Как мы уже объясняли, для измерения NOE можно выбирать метод в соответствии с целью.
Мы рекомендуем вам начать с 1D NOESY, который позволяет легко задавать условия и получать четкие спектры.
-----
Целевой протон определен: одномерное измерение
Хотите увидеть NOE по всей молекуле, или назначение сигнала неопределенно: 2D NOESY
-----

Важный фактор для измерения NOE: время релаксации

Одной из самых неприятных проблем при измерениях NOE, без сомнения, является «когда сигнал NOE не обнаружен!»
В таком случае, пожалуйста, измерьте время продольной релаксации (T₁) целевого образца, в первую очередь.
Затем для измерения разницы NOE установите время облучения возбуждающего импульса так, чтобы оно было больше, чем в 5 раз больше времени T₁ целевого образца.
Также установите время смешивания с 1D/2D-NOESY, которое должно быть примерно в 0.8 раза больше времени смешивания T.₁ целевого образца.

Итак, почему нам необходимо учитывать время релаксации целевого образца при измерении NOE?
Это связано с тем, что NOE имеет тесную связь со временем релаксации, поскольку NOE представляет собой явление релаксации, основанное на дипольном взаимодействии.

Здесь мы хотели бы дать простое объяснение релаксации в ЯМР.

Выше представлена ​​схематическая диаграмма уровней энергии ядерного спина со спиновым числом = 1/2, когда он
В статическом магнитном поле ядерный спин переходит в два энергетических состояния после расщепления Зеемана под воздействием магнитного поля.
Стабильное состояние с низкой энергией называется α-состоянием, а состояние с высокой энергией называется β-состоянием.
При облучении радиоволны, имеющей частоту, эквивалентную этой энергетической щели, спин в α-состоянии поглощает энергию радиоволны и возбуждается в β-состояние.
Когда под действием радиоволны спиновые числа состояний α и β становятся одинаковыми, поглощение энергии прекращается, что называется состоянием насыщения.
В состоянии насыщения спин в β-состоянии испускает энергию и возвращается в α-состояние, а затем даже в состояние теплового равновесия. Весь этот процесс называется релаксацией.
Затем серия процессов от возбуждения до релаксации называется явлением ЯМР, которое мы наблюдаем.

Взаимодействие происходит между двумя соседними ядерными спинами, что является движущей силой релаксации, описанной ранее. В ЯМР растворов дипольное взаимодействие является одним из основных факторов, способствующих релаксации. Поэтому определение параметра времени релаксации, тесно связанного с дипольным взаимодействием, является важным ключом к успешному наблюдению ЯЭО.

Причина и решение проблемы необнаруживаемых сигналов NOE

Вероятная причина и действия в случае, если NOE не обнаружен, поясняются в следующих 4 пунктах.

• Оптимизировать условия настройки/измерения образца

• Изменить молекулярное движение

• Изменить резонансную частоту

• Изменить метод измерения

Сначала проверьте, оптимизирован ли пункт 1, и если NOE не наблюдается, попробуйте пункты 2–4.

1. Оптимизация условий настройки/измерения образца

Поскольку сигнал NOE очень слабый, результат во многом зависит от концентрации и чистоты образца, а также от настройки условий измерения.

• Концентрация: если концентрация слишком высока, между молекулами имеет тенденцию происходить релаксация, ослабляя NOE.

• Меры предосторожности против загрязнения парамагнитными веществами: растворенным кислородом и ионами металлов (Fe, Cu и др.)_C.) способствуют расслаблению, тем самым предотвращая NOE.

• Установка времени облучения/смешивания: на основе T₁(время продольной релаксации), время облучения более 5 раз, время смешивания около 0.8 раза являются ориентировочными.

2. Изменить молекулярное движение

Интенсивность NOE также зависит от молекулярного движения.
На следующем графике показана связь между интенсивностью NOE и молекулярным движением.

Эта кривая была теоретически выведена из реляционного выражения интенсивности NOE и дипольного взаимодействия.

Вертикальная ось выражает интенсивность NOE, а горизонтальная ось выражает произведение частоты наблюдения ω на время корреляции молекулы t_C.
t_C Это время, необходимое молекуле для совершения полного оборота в растворе, и параметр, выражающий движение молекулы. Это означает, что чем меньше молекула, тем короче t_C Чем больше молекула, тем длиннее t_C становится.

Слева показана область низкой молекулы, где t_C короткая, а движение молекулы быстрое. В этом случае наблюдается положительный NOE.
С другой стороны, справа показана область полимера, где t_C длинная, а движение молекулы медленное. Здесь наблюдается отрицательный NOE. Это означает, что график показывает, что интенсивность NOE сильно меняется в зависимости от движения молекулы.

При проведении измерений важно наличие области, где NOE обращается в ноль.
Когда молекула находится близко к области, где произведение частоты наблюдения ω и времени корреляции молекулы t_C равен 1, то NOE становится очень слабым или NOE не наблюдается.

Следовательно, если NOE не наблюдается, даже если условия измерения проверяются с помощью вашего прибора, возможно, что произведение частоты наблюдения ω и времени корреляции молекулы t_C находится в этом регионе.

В таком случае, изменение ω или t_C это возможный выбор.
Однако изменение ω влечет за собой изменение измерительного магнитного поля, и если у вас в руках только один прибор, это может оказаться затруднительным.
Поэтому мы предлагаем вам рассмотреть возможность изменения t_C , то есть изменение фактора, который может повлиять на t_C(измерение температуры и вязкости растворителя).
Мы рекомендуем вам сначала изменить температуру измерения.

3. Изменить резонансную частоту

Далее я объясню случай, когда изменяется частота наблюдения, то есть изменяется магнитное поле измерения.

На рисунке выше показана зависимость интенсивности NOE от магнитного поля и времени корреляции t._C Вертикальная ось представляет интенсивность NOE, а горизонтальная ось представляет время корреляции t_CКаждая кривая соответствует магнитному полю от 90 до 920 МГц. Кривые смещаются влево по мере увеличения измеряемого магнитного поля. Если мы сосредоточимся на t_C в которой NOE становится равным нулю, мы можем видеть, что точка, в которой интенсивность сигнала становится равной нулю, смещается в область низких молекул (где молекулы находятся в быстром движении) по мере увеличения магнитного поля.
Это означает, что при тех же условиях измерения интенсивность сигнала положительного NOE ослабевает при более сильных магнитных полях. Например, можно сказать, что молекула с нулевым NOE в приборе с частотой 600 МГц может демонстрировать положительный NOE в приборе с частотой 300 МГц. Кроме того, в случае молекулы с молекулярной массой около 1000 высока вероятность того, что она может находиться в области круга, где NOE чрезвычайно малы, поэтому необходимо уделять этому особое внимание.

4. Измените метод измерения.

Если после применения методов 1–3, представленных ранее, NOE не наблюдается, используется метод измерения, называемый ROESY. ROESY — это измерение NOE во вращающейся системе координат.

На рисунке выше представлены спектры 1D NOESY и 1D ROESY грамицидина S, измеренные при 90°C.
При этой температуре NOE грамицидина S становится практически нулевым, но использование ROESY позволяет наблюдать корреляционные сигналы. NOE, наблюдаемый в ROESY, обозначается как ROE. Главное преимущество ROESY заключается в том, что, как показано на схематической диаграмме, ROE всегда положителен и не имеет нулевой области.
Вы можете спросить: «Тогда почему бы просто не использовать ROESY с самого начала?» Однако ROESY требует более тщательной настройки параметров и склонен генерировать нежелательные сигналы. Поэтому ROESY лучше использовать, когда NOESY работает неэффективно.

Часто задаваемые вопросы об измерении NOE

• Форма разностного сигнала NOE выглядит странно!!

  При измерениях разностного ЯЭО, если точка облучения не установлена ​​на максимуме пика, могут возникнуть эффекты спиновой связи, приводящие к изменению формы сигнала. Поэтому точку облучения следует устанавливать точно на максимуме пика.

  

  При измерениях разностного ЯЭО, когда селективно облучается больше мультиплетов, чем дублетов, и если точка облучения смещена от максимума пика, форма сигнала изменяется. Два спектра выше демонстрируют результаты разностного ЯЭО при облучении протонов метильной группы этилкротоната. Положительные сигналы ЯЭО наблюдаются в точках B и C. Если точка облучения смещена относительно центра сигнала A вместо максимума пика, появляется большой асимметричный сигнал, похожий на остаточный, как показано в пунктирной области верхнего спектра. Это обусловлено спин-спиновыми взаимодействиями с протоном B. При измерениях разностного ЯЭО всегда выбирайте точку облучения в максимуме пика.

• Почему малая молекула показывает отрицательный NOE?

  Это явление известно как косвенный NOE (трехспиновый эффект), и в малых молекулах его можно наблюдать, когда протоны расположены почти линейно.

  

  Обычно малые молекулы, быстро движущиеся в растворе, демонстрируют положительные сигналы NOE. Однако иногда сигналы могут появляться в том же направлении, что и отрицательный NOE. Например, рассмотрим пространственное расположение, показанное на рисунке слева, где протоны AB и BC расположены пространственно близко, а AC — далеко друг от друга. На рисунке справа показан одномерный спектр NOESY при селективном возбуждении протона A. Поскольку A и B расположены близко, положительный NOE наблюдается в точке B. Однако косвенный NOE может также появляться в точке C через точку B. Этот косвенный NOE проявляется в направлении, противоположном положительному NOE. Важно отметить, что этот сигнал не указывает на пространственную близость AC. Это явление, скорее всего, возникает, когда три протона расположены в пространстве почти линейно, и известно как «эффект трёх спинов».

• Почему NOE недоступен, хотя расстояние должно быть близким?

  Когда три протона расположены пространственно особым образом, NOE может не наблюдаться, даже если расстояния близки.

  

  В качестве частного случая эффекта трёх спинов позвольте мне объяснить проблему треугольника. Как показано на рисунке выше, эта проблема может возникнуть, когда три протона расположены в пространстве особым образом.

  

  При селективном возбуждении A сближаются не только расстояния между A и B, но и между A и C. Таким образом, предполагается, что положительный NOE наблюдается между A и C, прогнозируемый спектр показан справа на рисунке выше.

  

  Однако положительный NOE от A до C, показанный оранжевым цветом, и косвенный NOE через B, показанный зеленым цветом, могут компенсировать друг друга, что приводит к отсутствию наблюдаемого NOE.
  Теоретически, это погашение происходит, когда соотношение расстояний между каждой парой протонов составляет 1:1:1.26. Другими словами, даже если протоны пространственно близки, эффект NOE может не наблюдаться.

Референции

Claridge, DWT (2004), *Yūki kagaku no tame no kōbun Kainou NMR tekunikku* [Методы ЯМР высокого разрешения для органической химии] (T.Takeuchi & M. Nishikawa (Trans.) Kodansha Scientific.

Фукуши, Э. и Сохмия Х. (2007), *Korenara wakaru nijigen NMR* [Понимание 2D ЯМР стало проще]. Кагаку Додзин.

Родственное применение

Наблюдение NOE от HSQC-NOESY

Связаться с нами

Если вас интересуют исследования с использованием NOE или вы хотите узнать больше о спектрометре ЯМР, свяжитесь с JEOL. Мы предлагаем множество примеров применения и техническую поддержку, которые помогут вам в ваших исследовательских начинаниях.

Каталог